NGS-based rDNA barcoding in fungal species identification and delimitation : limits, opportunities and relation to phenotypic HT FT-IR spectroscopy

Abstract

The abundance of ribosomal DNA (rDNA) in the yeast and fungal genomes derives from their multigene nature. During the last decade of the XX century, this DNA region has become very popular for the molecular characterization of fungi. Unfortunately, the multigene nature of rDNA cannot be completely identified by the Sanger sequencing that records only the most prevalent nucleotide at each position. Conversely, Next Generation Sequencing (NGS) has unveiled the internal heterogeneity of rDNA, due to its mechanism of reporting individual reads. For these reasons, rDNA sequencing and particularly the Internal Transcribed Spacer (ITS) marker, have huge advantages in taxonomy, barcoding, ecological microbiology and diagnostics. The aim of this thesis was to achieve a closer understanding of the rDNA organization and to link molecular and phenotypical analysis in order to obtain a stable and meaningful phenetic taxonomy, which accounts for the phylogeny. The first part of the introduction of this thesis is a critical review of the literature on rDNA and its taxonomic variability. In the second part, the thesis illustrates how the application of new strategies to detect the variability within the rDNA, allows the identification and classification of species by analysing species derived from different environments that are relevant for white, green and red biotechnologies. Limitations of the significance of markers in the application of DNA-based molecular taxonomy of microorganisms are discussed. Therefore, to avoid a sterile taxonomic approach leading to a pure nomenclatural exercise, phenotypic characterization was associated to the genotyping of selected microorganisms. For this reason, as example, results obtained in studies on the ability of selected microorganisms to form biofilm in addition to their metabolomic characterization are presented. The biofilm forming ability of more than two hundred pathogenic strains belonging to Candida genus identified using ITS marker are presented. The relation between different variables was tested and results showed that species and biofilm forming ability appeared to be distributed almost randomly whereas the relation between biofilm formation and species isolation frequency was highly significant (R2 around 0.98). The identification of saprophytic filamentous fungi, which cause invasive infections, is also presented. In this case the current molecular diagnostic tools, based on the barcode marker ITS, failed in discriminating this fungi between the complex Trichoderma longibrachiatum/Hypocrea orientalis, even using different tools. The definitive identification was carried out combining molecular approach and microbiological test. A combined approach in the delimitation of ninety-six food-related strains of the complex Meyerozyma/Candida guilliermondii is presented. Results of both approaches (ITS and FT-IR spectroscopy) showed that the possibility to discriminate among strains with molecular and metabolomic analyses represents an additional tool to empower food and industrial monitoring and to gain further knowledge on the genetic variations of this species. In order to study the variability of the rDNA an NGS-like approach on a new species Ogataea uvarum sp.nov. was carried out. Results showed that the ITS marker was more variable than the LSU gene, especially in the ITS2 region. In order to test the origin of this heterogeneity the whole region was introduced in a mini library and several clones were sequenced separately. The cloning of a sample of single copy sequences showed that indeed an internal heterogeneity is present and that the process of generating a consensus using Sanger sequencing hides a large part of it. For instance, the introduction of NGS leads to a deeper knowledge of the individual sequences and of the variants between the same DNA sequences located in different tandem repeats. With this purpose, more than two hundred strains belonging to Candida genus were sequenced with NGS and a pipeline for the identification using different bioinformatics tools was carried out. The NGS also offers the possibility to evaluate this heterogeneity by analysing the Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) within the reads of an rDNA region amplified from a single strain DNA. Results performed on the four prevalent Candida species (C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis and C. tropicalis) indicated the presence of high variability among the strains and between the species, especially in the ITS2 region. Moreover, a combined approach on these four Candida species using NGS and FT-IR spectroscopy was applied in order to improve the identification of pathogenic strains. Multivariate data analysis (MVA) by Consensus Principal Component Analysis (CPCA) was carried out. Partial Least Squares Regression (PLSR) was applied to build a classification model based on most relevant IR variables. The model was then crossvalidated with the a success rate of 94.2%. Identification was also performed considering both the distance to the type strain and the central strain resulting in 97.4% correct classification. In conclusion, in this thesis an identification method for the diagnose of pathogenic yeasts was developed on the basis of NGS. The internal variability of the rDNA was exploited and the relative limitations of the current methodologies presented. The comparison of results from totally different characters (molecular vs. phenotypic) and expressed with different data types (categorical vs. continuous) is one of the challenges necessary to try a reconciliation between the molecular DNA-based taxonomy, characterized by stable and “potential” characters, and the phenotypic data describing “actual” traits of the cells.

Overflod av ribosomalt DNA (rDNA) i gjær og sopp genomer stammer fra deres multigen natur. I løpet av det siste tiåret av XX århundre, har denne DNA regionen blitt svært populært for molekylær karakterisering av sopp. Dessverre kan den multigene naturen av rDNA ikke fullstendig identifiseres ved Sanger-sekvensering, som registrerer bare de mest utbredte nukleotider ved hver posisjon. I motsetning har Next Generation Sequencing (NGS) avduket den interne heterogeniteten av rDNA, på grunn av sin mekanisme for rapportering av enkelte ‘reads’. Derfor har rDNA sekvensering og spesielt Internal transkribert Spacer (ITS) markører store fordeler i taksonomi, barcoding, økologisk mikrobiologi og diagnose. Målet med denne avhandlingen var å oppnå en bedre forståelse av rDNA organiseringen og å lage en forbindelse mellom molekylær og fenotypisk analyse for å oppnå en stabil og meningsfull fenetisk taksonomi, som uttrykker fylogenien. Den første delen av innledningen av denne avhandlingen er en kritisk gjennomgang av litteraturen om rDNA og dens taksonomisk variabilitet. I den andre delen, viser avhandlingen hvordan anvendelsen av nye strategier for å oppdage variasjonen innenfor rDNA, tillater identifisering og klassifisering av arter ved å analysere arter som stammer fra ulike miljøer som er relevante for hvite, grønne og røde bioteknologi. Begrensninger i betydningen av markører i anvendelsen av DNA-baserte molekylære taksonomi av mikroorganismer diskuteres. Derfor, for å unngå en steril taksonomisk tilnærming som fører til en ren taksonomi øvelse, ble fenotypisk karakterisering knyttet til genotypingen av utvalgte mikroorganismer. Derfor presenteres, for eksempel, det resultater som er oppnådd i biofilmstudier, hvor evnen av utvalgte mikroorganismer for dannelse av biofilm i tillegg til deres metabolomisk karakterisering undersøkes. Evnen til å danne biofilm ble presentert for mer enn to hundre patogene stammer tilhørende slekten Candida og som er identifisert ved hjelp av markeringen ITS. Forholdet mellom evnen til å danne biofilm og artene ble undersøkt. Resultatene viste at det ikke er noe korrelasjon mellom arten og biofilmformingsevne, mens korrelasjonen mellom biofilmdannelse og isolasjonsfrekvensen for arten. Identifiseringen av saprophytic trådformede sopp, som forårsaker invasive infeksjoner, blir også presentert. I dette tilfellet, mislykkes dagens molekylære diagnostiske verktøy basert på strekkode markør ITS i å diskriminere denne sopparten i komplekset Trichoderma longibrachiatum/Hypocrea orientalis, selv ved hjelp av ulike verktøy. Den endelige identifikasjonen ble utført ved å kombinere molekylær tilnærming og mikrobiologiske test. En kombinert tilnærming i avgrensningen av nitti-seks matrelaterte stammer av komplekset Meyerozyma/Candida guilliermondii er presentert. Resultater av begge tilnærminger (ITS og FT-IR spektroskopi) viste at muligheten til å diskriminere mellom stammer med molekylære og metabolomiske analyser representerer et tilleggsverktøy som kan styrke mikrobiell kontroll i matindustri og for å få mer kunnskap om de genetiske varianter av denne arten. For å studere variasjonen av rDNA ble en NGS-lignende metode testet for en ny art Ogataea uvarum sp.nov. Resultatene viste at ITS markøren var mer variabel enn LSU genet, spesielt i ITS2 regionen. For å teste opprinnelsen av denne heterogeniteten, ble hele regionen innført i en mini-bibliotek og flere kloner ble sekvensert separat. Kloning av et utvalg på enkelkopi sekvenser viste at faktisk en intern heterogenitet er til stede, og at prosessen med å generere en konsensus ved hjelp av Sanger-sekvensering skjuler en stor del av denne heterogeniteten. Innføringen av NGS fører til en dypere forståelse av de individuelle sekvensene og av variantene mellom de samme DNA-sekvensene som ligger i forskjellige tandemrepetisjoner. Med dette formålet, ble mer enn to hundre stammer tilhørende Candida slekten sekvensert med NGS og en rutine for identifisering ved hjelp av ulike bioinformatiske analyser ble satt opp. NGS tilbyr også muligheten for å evaluere heterogeniteten ved å analysere enkelt-nukleotider (SNPs) i lesninger av en rDNA region amplifisert fra DNAen til en enkelt stamme. Resultatene utført på de fire viktigste Candida-arter (C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis og C. tropicalis) indikerte tilstedeværelse av høy variabilitet blant stammene og mellom artene, spesielt i ITS2 regionen. Videre ble en studie gjennomført, hvor en kombinasjon av NGS og FT-IR-spektroskopi ble utført for de fire Candida-artene for å forbedre den identifikasjon av patogene stammer. Multivariat dataanalyse (MVA) ved Konsensus Principal Component Analyse (CPCA) ble utført. Partial Least Squares Regression (PLSR) ble brukt til å bygge en klassifiseringsmodell basert på de mest relevante IR variablene. Modellen ble deretter kryss-validert med en suksessrate på 94,2%. Identifikasjon ble også utført med tanke på både avstanden til typestammen og den sentrale artsstammen og resulterte i 97,4% korrekt identifisering. I denne avhandlingen ble en identifikasjonmetode for diagnose av patogene gjærsopper utviklet på basis av NGS. Den nye metoden utnytter den indre variasjon av rDNA. De relative begrensningene ved eksisterende metoder blir diskutert. Sammenligningen av identifikasjonsresultater som stammer fra data med helt forskjellige karakterer (molekyl vs. fenotypiske) og som er uttrykt med ulike datatyper (kategoriske vs. kontinuerlig) er nødvendig hvis man vil komme fram til en avstemming mellom en molekylær DNAbaserte taksonomi, preget av stabil og "potensielle" tegn, og en fenotypiske taksonomi som beskriver egenskapene til cellene.