A study of potential energy sources used by cheese ripening bacteria

Abstract

Non-starter lactic acid bacteria (NSLAB) continue to grow in cheese during ripening even though lactose and its monosaccharide moieties (glucose and galactose (Gal)) are depleted. This indicates that the NSLAB are able to utilize other energy sources present in the cheese during ripening. Components from the starter bacteria, amino acids (AA), citrate and carbohydrates from the milk fat globule membrane have all been suggested as potential sources of energy for NSLAB, however, the substrates used during cheese ripening are currently not clearly defined. The objective of this work was to study potential energy sources used by cheese ripening bacteria during cheese ripening, with the hypothesis that carbohydrates from the glycoconjugates found in the milk fat globule membrane (MFGM) are essential for the development of bacteria during cheese ripening. The growth and metabolism of selected Lactobacillus (Lb.) paracasei, Lb. plantarum INF15D, Lactococcus lactis subsp. lactis ML8 and Enteroccus (Ec.) hirae INFE1 when grown in a model system added MFGM or its monosaccharide components as the only potential carbon sources was studied. Analysis of catabolic- as well as anabolic products have been conducted during growth of the bacteria, using high performance liquid chromatography for organic acids, carbohydrates and AA. Gas chromatography was used to monitor volatile compounds. Two dimensional gel electrophoresis was used to chart the protein expressions of Lb. plantarum INF15D when grown on the single monosaccharides found in the MFGM. Matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry was ultimately used to identify proteins of interest from the two dimensional gels. The effect of the difference in MFGM monosaccharide utilization between NSLAB was explored in a cheese making trial using MFGM rich buttermilk powder as an addition to the cheese milk. The lactic acid bacteria (LAB) studied, all relevant to cheese production and ripening, were able to grow and survive for an extended period of time with a bovine MFGM isolate as the only potential carbohydrate source. All isolates were able to effectively utilize most of the monosaccharides found in MFGM glycoconjugates. Growth of Lb. plantarum INF15D on the acylated aminosugar N-acetylglucosamine (GlcNAc) led to induction of enzymes involved in the degradation of this sugar through the GlcNAc pathway, and this yielded large amounts of acetate as a degradation product. Presumably, the large amounts of acetate released from the degradation of N-acetylgalactosamine (GalNAc) and GlcNAc induced a decrease of cultivable number of bacteria at an earlier stage than when incubated on any of the other monosaccharides. The potential cheese contaminant Ec. hirae INFE1 showed superior growth and survival abilities compared with the other LAB when grown on the MFGM media, and on several of the MFGM monosaccharides. Enzymes involved in two different pathways yielding energy from serine (Ser) were found in Lb. plantarum INF15D, whereas none of the studied Lb. paracasei strains decreased the levels of Ser when grown on any of the monosaccharides. Growth of Lb. plantarum INF15D on Gal resulted in a metabolic shift expressed as different fates of the produced pyruvate compared to growth on the other monosaccharides, as well as initiation of degradation of some AA known to potentially take part in energy production, specifically arginine and tyrosine. Enzymes involved in ribose metabolism as well as phosphoketolase pathway enzymes were upregulated, leading to the production of ethanol and acetate. These findings indicate that Lb. plantarum INF15D are able to utilize several different substrates for energy at the same time to secure growth and survival during sub-optimal conditions. The cell shape determining protein MreB, that leads to elongation of the cells was also found to be upregulated during growth of Lb. plantarum INF15D on Gal. Cheeses were made with the addition of butter milk, and low initial numbers (log 2 cfu/mL cheese milk) of two different Lb. paracasei adjunct cultures (INF448 and INF456) known to be different in their utilization of the MFGM monosaccharide GalNAc. A low initial number was used to mimic the content of NSLAB normally found in cheese milk. Even if the Lb. paracasei adjuncts have the ability to utilize the MFGM components, they did not dominate the NSLAB microflora in the cheese in the later stages of ripening. The starter bacteria were located within the protein networks in clusters which were distributed homogeneously throughout the cheese matrix regardless of additive, while lactobacilli were rare, and when found, they were in huge clusters of clearly elongated cells.

Bakterier som ikke er en del av den tilsatte syrekulturen (NSLAB) fortsetter å vokse i ost selv om laktose og dets monosakkaridkomponenter (glukose og galaktose (Gal)) er oppbrukt. Dette indikerer at NSLAB er i stand til å utnytte andre energikilder som er tilstede i osten under modning. Komponenter fra syrekulturbakterier, aminosyrer, sitrat og karbohydrater fra melkens fettkulemembran har alle blitt foreslått som mulige energikilder for NSLAB. Hvilke substrater som blir benyttet av NSLAB under ostemodningen er imidlertid ikke klart definert. Formålet med dette arbeidet var å studere mulige energikilder som benyttes av bakteriene i osten under modning. Hypotesen var at karbohydrater fra glukokonjugater som finnes i melkens fettkulemembran er avgjørende for utviklingen av bakterier under ostens modning. Vekst og metabolisme av utvalgte Lactobacillus (Lb.) paracasei, Lb. Plantarum INF15D, Lactococcus lactis subsp. lactis ML8 og Enteroccus (Ec.) hirae INFE1 dyrket i et modellsystem med melkens fettkulemembran eller dens monosakkaridkomponenter ble studert. Analyser av katabolske- samt anabolske produkter ble utført under bakterienes vekst ved bruk av høytrykks væskekromatografi til organiske syrer, karbohydrater og aminosyrer. Gasskromatografi ble benyttet til analyse av flyktige forbindelser. Todimensjonal gel elektroforese ble brukt til å kartlegge proteinuttrykkene til Lb. plantarum INF15D dyrket på de enkelte monosakkaridene som finnes i melkens fettkulemembran. Matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) massespektrometri ble brukt til å identifisere proteiner av interesse fra de todimensjonale gelene. Effekten av forskjellene mellom bakterienes egenskaper til å utnytte monosakkaridene som finnes i melkens fettkulemembran ble utforsket i et ystingsstudie, hvor ystemelken ble tilsatt kjernemelk rik på fettkulemembrankomponenter. Melkesyrebakteriene som ble studert, som alle er relevante i osteproduksjon og modning, var i stand til å vokse og overleve i en lengre periode med fettkulemembran, isolert fra kumelk, som eneste potensielle karbohydratkilde. Alle isolatene var i stand til å effektivt utnytte de fleste monosakkaridene som finnes i glykokonjugatene i melkens fettkulemembran. Vekst av Lb. plantarum INF15D på det acetylerte aminosukret N-acetylglukosamin (GlcNAc) førte til en høyere produksjon av enzymer som er involvert i nedbrytningen av dette sukret via GlcNAc nedbrytningsveien, og dette førte til at store mengder eddiksyre ble frigjort som et nedbrytningsprodukt. Det er trolig at de store mengdene eddiksyre som ble frigjort under nedbrytningen av N-acetylgalaktosamin (GalNAc) og GlcNAc førte til en nedgang i antallet dyrkbare bakterier på et tidligere stadium, enn ved vekst på noen av de andre monosakkaridene. Sammenliknet med de andre melkesyrebakteriene som ble studert hadde den potensielle ostekontaminanten Ec. hirae INFE1 overlegne vekst- og overlevelsesegenskaper da den vokste på fettkulemembranmedie og på flere av fettkulemembranens monosakkarider. Enzymer involvert i to ulike nedbrytningsveier, som begge gir energi fra serin (Ser), ble funnet i Lb. plantarum INF15D, mens ingen av de studerte Lb. paracasei stammene reduserte nivået av Ser da de ble dyrket på noen av monosakkaridene. Vekst av Lb. Plantarum INF15D på Gal resulterte i et metabolsk skift, hvor pyruvat ble degradert via andre nedbrytningsveier enn ved vekst på noen av de andre monosakkaridene. Nedbrytning av aminosyrer som potensielt kan utnyttes til energi (arginin og tyrosin) ble i tillegg initiert. Enzymer som er involvert i nedbrytningen av ribose samt i fosfoketolase nedbrytningsveien ble oppregulert, noe som førte til produksjon av etanol og eddiksyre. Disse funnene indikerer at Lb. plantarum INF15D er i stand til å samtidig utnytte flere forskjellige substrater til produksjon av energi for å sikre vekst og overlevelse under forhold som ikke er optimale. Proteinet MreB som er med på å bestemme bakteriecellens form ble i tillegg oppregulert da Lb. plantarum INF15D ble dyrket på Gal. Oster ble produsert med ystemelk tilsatt kjernemelkpulver og med lavt antall (log 2 kde/mL) av to ulike tilsatte Lb. paracasei kulturer som det var kjent at hadde ulik evne til å utnytte monosakkarider fra melkens fettkulemembran. Et lavt antall tilsatte bakterier ble benyttet for å simulere innholdet av NSLAB som normalt finnes i ost. Selv om Lb. Paracasei stammene kunne benytte seg av komponenter fra melkens fettkulemembran, så førte dette ikke til at de dominerte mikrofloraen i osten på et sent stadium i modningen. Syrekulturbakterier ble lokalisert i osten i kolonier som var homogent distribuert i hele ostematrixen uavhengig av tilsetning til ystemelken, mens lactobasiller var distribuert i få og store ansamlinger med tydelig forlengede celler.