Inosine-independent roles of human Endonuclease V

Abstract

Endonuclease V (EndoV) is a highly conserved enzyme with specificity for inosines in nucleic acids. The bacterial EndoVs are active both on DNA and RNA, whereas the human (h) homolog (hEndoV) cleaves only at inosines in RNA. In DNA, inosine is regarded a damage and the role of hEndoV as a repair enzyme is well acknowledged. In contrast, the biological function of hEndoV upon RNA is still unknown. Non-coding RNAs are involved in many cellular processes, but the biological role and significance of many of them remains uncertain. Y RNAs are a family of non-coding RNAs conserved in vertebrates that are often components of ribonucleoproteins (RNPs) complexed with Ro60 (RoRNP). Ro60 is a conserved RNA-binding protein that was first characterized as an antigen targeted by autoantibodies from patients with systemic lupus erythematosus and Sjögren ́s syndrome. No interaction between hEndoV and Ro60 is known, but both are found to interact with the RNA binding proteins Y-Box protein (YBX) and insulin-like growth factor-2 mRNA-binding protein 1 (IGF2BP1).

The goal for this thesis was to confirm an individual-nucleotide resolution crosslinking immunoprecipitation (IP) assay (iCLIP) where certain tRNAs and Y RNAs were found as possible targets for hEndoV. This was done by biochemical activity assays and electrophoretic mobility shift assays (EMSA) using tRNAs with and without inosine and Y RNA1 and Y RNA4 as substrates. Three variants of recombinant hEndoV were used. The Y RNA transcript levels of hEndoV were also studied in a quantative reverse transcriptase PCR (RT-qPCR) analysis. In addition, hEndoV interactions with YBX1, IGF2BP1 and Ro60 were investigated further by co-immunoprecipitation assay and immunocytochemistry (ICC).

The results show that hEndoV both bind and cleave all tRNAs and Y RNAs tested and this was independent of the presence of inosines. Moreover, interaction of hEndoV with YBX1 and IGF2BP1 but not Ro60, was confirmed. These data suggest that hEndoV may have a broader role in the cells beyond processing inosine-containing RNA. Though, inosine- containing RNA appears to be the best substrate for hEndoV.

Endonuklease V er et godt konservert enzym med spesifisitet for inosin i nukleinsyrer. De bakterielle EndoV ́er er aktive både på DNA og RNA, mens den humane homologen kun kutter ved inosin i RNA. I DNA blir inosin sett på som en skade, og rollen til hEndoV som et reparasjonsenzym er annerkjent. I motsetning er den biologiske funksjonen til hEndoV fortsatt ukjent. Ikke-kodende RNA er involvert i mange cellulære prosesser, men den biologiske rollen og signifikansen til mange av dem er fortsatt usikker. Y RNA er en familie av ikke-kodende RNA konservert i vertebrater og som ofte er komponenter av ribonuklein proteiner sammen med Ro60. Ro60 er et RNA-bindene protein som først ble karakterisert som et antigen for autoantistoffer fra pasienter med systemisk lupus erythematosus og Sjögren ́s syndrom. Ingen interaksjon mellom hEndoV og Ro60 er kjent, men begge har blitt rapportert å interagere med de RNA bindende proteinene YBX1 og IGF2BP1.

I denne oppgaven var målet å bekrefte funnene i en iCLIP analyse der tRNA og YRNA ble funnet bundet til hEndoV. Dette ble gjort med biokjemisk aktivitetsassay og EMSA analyse hvor tRNA både med og uten inosin og Y RNA1 og Y RNA4 ble benyttet som substrater. Tre varianter av rekombinant hEndoV ble brukt. Om Y RNA transkript-nivåer ble påvirket av mengden hEndoV i cellene ble også undersøkt i en RT-qPCR analyse. I tillegg ble hEndoV ́s interaksjoner med YBX1, IGF2BP1 og Ro60 undersøkt videre med co-immunopresipitering og ICC.

Resultatene viser at hEndoV både binder og kutter alle tRNA og Y RNA som ble undersøkt. Binding og aktivitet ble funnet å være uavhengig av tilstedeværelsen av inosin. Interaksjoner av hEndoV med YBX1 og IGF2BP1 ble bekreftet, men ingen interaksjon mellom hEndoV og Ro60 ble funnet. Disse dataene viser at hEndoV kanskje har en bredere rolle i cellene utover å prosessere inosinholdig RNA. Dog er inosinholdig RNA det foretrukne substratet til hEndoV