Identification and CRISPR editing of pathogen responsive genes in Lactuca Sativa

Abstract

One of the greatest challenges faced by humanity today is to feed the estimated population of 10 billion people by 2050 in the face of climate change. Plant pathogens are still a major challenge for agriculture and one of the most promising ways for efficient and sustainable management of plant pathogens is the use of gene editing tools to generate new improved crop cultivars.

The plant pathogen Sclerotinia Sclerotiorum causes a disease commonly known as white mold on a wide range of host plants, including Lactuca Sativa (lettuce). This brings significant losses on lettuce yields (reportedly up to 30 %) and results in agricultural and economic challenges for the farmers.

The aim of this study is to conduct functional analysis of genes possibly involved in the S. sclerotorium pathogenesis in lettuce, by developing CRISPR-Cas9 knockout-constructs for targeted mutagenesis on candidate genes. Ultimately gene edited L. sativa lines with enhanced resistance against the plant pathogen S. Sclerotiorum would be generated. Bioinformatical analysis, literature search and RT-qPCR gene expression analysis of infected and uninfected lettuce were used to identify target genes. CRISPR-constructs with sgRNA specifically designed for three target genes were constructed to perform the study. The cloning system used in this thesis consisted of Escherichia Coli, for transformation and propagation of the CRISPR expression vectors, and Agrobacterium Tumefaciens binary vector system, which delivered the CRISPR-constructs into the L. Sativa plants. The CRISPR-constructs were tested in both stable and transient A. tumefaciens-mediated plant transformation. Unfortunately, the plant transformation experiments were not completed due to the COVID-19 outbreak which caused the Norwegian government to inflict lock-down on most public institutions, including Nibio.

En av de største utfordringene menneskeheten står ovenfor i dag er å produsere mat til den forventede befolkningen på 10 milliarder innen 2050. Plantepatogener er fremdeles en stor utfordring for landbruket, og en av de mest lovende metodene for en effektiv og bærekraftig forvaltning av plantepatogener er bruken av genredigeringsverktøy for å generere nye og forbedrede kultivarer. Plantepatogenet Sclerotinia Sclerotiorum forårsaker råtesopp på en rekke vertsplanter, inkludert Lactuca Sativa (salat). Råtesoppen forårsaker betydelige tap for salatavlingene (opptil 30%) og resulterer i landbruks- og økonomiske utfordringer for bøndene. Målet med dette studiet er å gjennomføre en funksjonell analyse av gener som muligens er involvert i S. sclerotorium patogenese i salat ved å utvikle CRISPR-Cas9 knockout konstrukter for målrettet mutagenese på kandidatgener. Hensikten er å genere genredigerte L. sativa-linjer med forbedret resistens mot plantepatogenet S. sclerotiorum. Bioinformatisk analyse, litteraturstudier og RT-qPCR genekspresjonsanalyse av infisert og frisk salat ble brukt til å identifisere målgener. CRISPR-konstrukter med sgRNA, spesifikt designet for tre målgener, ble konstruert for å gjennomføre studiet. Kloningssystemet som ble brukt i denne oppgaven besto av Escherichia Coli for transformasjon av CRISPR ekspresjonsvektorer og Agrobacterium Tumefaciens binær vektorsystem, som overførte CRISPR-konstruktene til L. Sativaplantene. CRISPR-konstruktene ble testet med to typer A. tumefaciens-mediert plantetransformasjon. Dessverre ble ikke transformasjonseksperimentene fullført på grunn av COVID-19 utbruddet som førte til at den norske regjeringen innførte unntakstilstand som berørte de fleste offentlige institusjoner, inkludert NIBIO.