New genomics and transcriptomics tools toward improving conservation strategies for sturgeons

Abstract

Sturgeons (Family Acipenseridae) are one of the largest and most primitive fish families on Earth. Although they have always been typically distributed throughout the Northern Hemisphere, during the last decades wild populations have declined due to anthropogenic factors such as overfishing, poaching, pollution, and habitat loss. The situation is particularly dramatic for Atlantic sturgeon, one of the most ancient species among the family, which is currently extinct in Europe. In order to reintroduce the Atlantic sturgeon in Europe, several Baltic countries have been working together for more than two decades to build an ex-situ broodstock locally with fish derived from Canada, where the populations are not threatened, and releasing juveniles into the rivers flowing to the Baltic Sea.However, rearing fish aimed for restocking in the same manner as aquacultured fish has been shown to impact the post-release survival of juveniles in the long term. For example, in aquaculture conditions, fish are often maintained in high densities, at constant photoperiod and temperature conditions, and feeding on commercial pellets, leaving them cognitively naïve when released into natural environments. Additionally, increased water temperatures due to global warming have a strong influence on the geographic distribution of the species, resulting in local extinctions and population shifts. Although the effect of heat and cold stress on the juvenile and embryonic development have been assessed for several sturgeon species, most studies on gene expression have looked at a very limited number of genes due to the lack of sequence information and genomic resources. Also, most studies use other sturgeon species such as Siberian, Japanese, and white sturgeons, which are widespread aquacultured species. Exposing fish to temperatures higher than the optimal can trigger phenotypic adaptations leading to increase thermotolerance and potentially improve postrelease survival, however the impact of temperature-training protocols on the response to a subsequent heat shock has not yet been assessed in sturgeons. Therefore, the main aim of this thesis was to generate genomic and transcriptomic resources for Atlantic sturgeon, which are essential to improve and promote research in many fields, such as ecology, physiology and evolutionary studies. Moreover, it provides a reference for RNAseq-mediated transcriptome mapping. Additionally, we have used these resources to develop and evaluate the impact of novel rearing techniques toward improving restoration success, focusing on temperature training. First, we have assembled a high-quality de novo transcriptome, made an inventory of all the heat shock protein (HSP) gene family members and exposed a cell line derived from Atlantic sturgeon larvae to a moderate and severe heat shock in order to identify all heat-responsive genes using an RNAseq approach (Paper I). We found 76 HSP genes in the Atlantic sturgeon transcriptome, only 16 of which were responsive to at least one of the applied heat shock protocols, and only 5 of which were consistently upregulated after both moderate and severe heat shock at all the tested timepoints. After building the reference transcriptome and annotating all the HSP genes, we have evaluated the differences in liver transcriptome between temperature-trained and nontrained juveniles upon exposure to a new heat shock (Paper II). After four weeks of treatment, fish exposed to temperature training showed between 2 to 4 fold less dysregulated genes in response to a new heat shock than the non-trained group, indicating their improved ability to maintain transcriptomic homeostasis during a new heat shock. Again, like in the in vitro experiment, very few of the annotated HSP genes were dysregulated in response to heat shock in the liver transcriptome, namely hspa1, hspc1 and dnajb4. Overall, the response to heat shock in the liver transcriptome was milder than the in vitro response, which is likely a consequence of the activation of compensatory mechanisms. These mechanisms include the neuroendocrine system and result in increased tissue protection and thermogenic capacities, especially in the trained fish. We therefore propose that temperature-training protocols like the one tested in this thesis should be included in the set of new rearing techniques for fish used for restocking; however, other protocols should be investigated. Since the main bottleneck in the evaluation of the effect of such training is the lack of sequence information and a reference genome for RNAseq experiments, we have additionally assembled a reference genome for Atlantic sturgeon using a combination of short and long-read sequencing technologies (Paper III). The assembled genome provides for the first time clear evidence of a sturgeon-specific whole-genome duplication event (SR), independent from the American paddlefish (Polyodon spathula), which is the main representative of the sister Family (Polyodontidae) within the same Order (Acipensiformes). The presence of duplicated Hox clusters, together with synteny and phylogenetic studies of these developmental genes, and the results of microsatellite loci analysis, suggests that sturgeons have a paleotetraploid origin, and that a rediploidization process is still ongoing. In summary, the results presented in this thesis advance the field of sturgeon research. We hypothesized that temperature training has a positive effect during the exposure to a subsequent heat shock, but its potential to improve post-release survival in the long term should still be assessed. We therefore suggest that future work should be aimed at the optimization of rearing methods for stocking programs and that a reference genome should be used.

Stør (Familie Acipenseridae) er blant de største og mest primitive familier av benfisk. Mens de opprinnelig var utbredt over hele den nordlige halvkule, er mange populasjoner nå kritisk truet på grunn av menneskeskapte faktorer som overfiske, forurensning og tap av habitat. Situasjonen er spesielt dramatisk for atlantisk stør, en av de eldste artene i familien, som er utdødd i Europa. For å gjeninnføre atlantisk stør, har flere baltiske land arbeidet for å etablere en ex situ stamfiskpopulasjon basert på fisk fra Canada (hvor bestanden ikke er truet), for produksjon av yngel til utsetting i baltiske vassdrag. Imidlertid gir produksjon av settefisk etter samme prinsipper som for oppdrettsfisk svært lav overlevelse i naturen. Eksempelvis vil høy tetthet, konstant fotoperiode og vanntemperatur, og fôring med pellets til faste tider gi en kognitivt naiv fisk som ikke klarer seg i det fri. I tillegg kommer økte vanntemperaturer som resultat av global oppvarming, og som har stor innvirkning på den geografiske fordelingen av arter, som igjen resulterer i lokal utryddelse og forflytning av populasjoner. Selv om effekter av vanntemperatur har blitt undersøkt på embryonal- og yngelutviklingen i flere størarter, har de fleste studier fokusert på et lite sett av gener fordi genomiske ressurser har manglet. I tillegg er de fleste studiene utført på andre arter som er vanlig i akvakultur, slik som sibirsk, japansk og hvit stør. Eksponering til vanntemperaturer som er høyere enn artens optimum, kan utløse fenotypiske tilpasninger som fører til økt termotoleranse og potensielt forbedre overlevelse i naturen. Men effekten av slike temperaturtreningsprotokoller på responsen på et påfølgende varmesjokk er ikke studert i stør. Hovedmålet med denne avhandlingen var å generere genomiske og transkriptomiske ressurser for atlantisk stør, som en viktig faktor for å forbedre og fremme forskning innen økologi, fysiologi og evolusjon. Videre gir avhandlingen en referanse for RNAseq-mediert transkriptomkartlegging. Disse ressursene er så benyttet til å utvikle og evaluere virkningen av nye oppdrettsteknikker for settefisk, med fokus på temperaturtrening. Først har vi satt sammen et høykvalitets de novo transkriptom, deretter karakterisert genfamilien av varmesjokkproteiner (HSP), og så eksponert en cellelinje avledet fra atlantiske størlarver for et moderat og et kraftig varmesjokk for å identifisere alle varmeresponsive gener ved bruk av RNAseq (Artikkel I). Vi fant 76 HSP-gener i transkriptomene fra atlantisk stør, hvorav 16 responderte på minst en av de testede varmesjokkprotokollene, og bare 5 av disse ble konsekvent oppregulert etter både moderat og kraftig varmesjokk ved alle testede tidspunkt. Etter å ha bygget referansetranskriptomet og karakterisert alle HSP-gener, evaluerte vi forskjellene i levertranskriptom mellom temperaturtrent og ikke-trent yngel ved eksponering for et nytt varmesjokk (Artikkel II). Etter fire ukers behandling viste fisk som ble utsatt for temperaturtrening mellom 2-4 ganger færre dysregulerte gener som svar på et nytt varmesjokk sammenlignet med den ikke-trente gruppen. Dette antyder en forbedret evne til å opprettholde transkriptomisk homeostase under et nytt varmesjokk. I likhet med in vitro eksperimentet var svært få HSP-gener dysregulert som respons på varmesjokk i levertranskriptomet, nemlig hspa1, hspc1 og dnajb4. Totalt sett var responsen på varmesjokk i levertranskriptomet mildere enn in vitro responsen, noe som sannsynligvis skyldes ulike kompensatoriske mekanismer. Disse inkluderer det nevroendokrine systemet og resulterer i økt vevsbeskyttelse og termogen kapasitet, spesielt i trent fisk. Selv om andre protokoller bør undersøkes nærmere, foreslår vi at protokoller for temperaturtrening lik den som ble testet i denne avhandlingen bør vurderes i nye oppdrettsprotokoller for settefiskproduksjon av stør. Siden den viktigste flaskehalsen i evalueringen av effekten av slik trening er mangelen på sekvensinformasjon og et referansegenom for RNAseq-eksperimenter, har vi i tillegg produsert et referansegenom for atlantisk stør ved bruk av ulike sekvenseringsteknologier for korte og lange reads (Artikkel III). Genomet gir for første gang klare bevis for en størspesifikk helgenomdupliseringshendelse (SR), uavhengig av spadestør (Polyodon spathula), som er hovedrepresentanten for søsterfamilien (Polyodontidae) innenfor samme Orden (Acipensiformes). Tilstedeværelsen av dupliserte klynger av hox-gener som er sentrale i tidlig utvikling, i tillegg til hox-gen synteni og fylogeni, og mikrosatellitt loci-analyser, antyder at stør har en paleotetraploid opprinnelse, og at en rediploidiseringsprosess fortsatt pågår. Oppsummert vil de forbedrete genomiske og transkriptomiske verktøy presentert i denne avhandlingen åpne for nye muligheter innen størforskning. Videre har temperaturtrening en positiv effekt ved eksponeringen til varmesjokk, men potensialet for temperaturtrening og dermed økt overlevelse ved utsett bør undersøkes videre.

Os esturións (Familia Acipenseridae) pertencen a unha das familias de peixes mais grandes e primitivas da Terra. Aínda que sempre estiveron distribuídos no hemisferio Norte, nas últimas décadas as poboacións salvaxes teñen diminuido debido a factores antropoxénicos como a sobrepesca, a caza furtiva, a contaminación e a perda do hábitat. A situación é especialmente dramática para o esturión Atlántico, unha das especies máis antigas da familia que se atopa extinta en Europa na actualidade. Co fin de reintroducir o esturión Atlántico en Europa, varios países bálticos levan traballando xuntos durante máis de dúas décadas para construír un núcleo reprodutor con peixes derivados de Canadá, onde a poboación non esta ameazada, e liberar xuvenís nos ríos que flúen ao Mar Báltico. Non obstante, cultivar peixe destinado ao repoboamento utilizando as mesmas técnicas típicamente utilizadas en acuicultura afecta negativamente á supervivencia a longo prazo. Por exemplo, en condicións de acuicultura os peixes adoitan producirse en altas densidades, baixo condicións abióticas constantes (fotoperíodo e temperatura), e aliméntanse de pellets comerciais, producindo animais congitivamente inxenuos cuando son libertados no ambiente natural. Ademais, o aumento das temperaturas da auga debido ao quentamento global ten unha forte influencia na distribución xeográfica das especies, dando lugar a extincións locais. Aínda que os efectos do estrés térmico no desenvolvemento embrionario e etapas xuvenís xa teñen sido avaliados en varias especies de esturións, a maioría dos estudos de expresión xénica céntranse en un número moi limitado de xenes debido á falta de recursos xenómicos. Ademáis, a maioría dos estudos utilizan outras especies de esturións como o branco, siberiano ou xaponés, mais comúns en acuicultura. A exposición dos peixes a temperaturas superiores ás óptimas pode desecandear adaptacións fenotípicas resultando nun incremento da tolerancia térmica e potencialmente unha mellora da supervivencia no hábitat onde son libertados. Sen embargo, os efectos do réxime de temperatura utilizado durante a cría na resposta a un choque de calor posterior non teñen sido avaliados. Por todo isto, o obxectivo principal desta tese foi xerar recursos xenómicos e transcriptómicos para o esturión Atlántico, esenciais para mellorar e promover a investigación en moitos campos da ciencia como a ecoloxía, fisioloxía e a xenómica evolutiva, ademais de fornecer unha referencia para o mapeado do transcriptoma. Ademais, empregamos estes recursos para desenvolver e avaliar o impacto de novas técnicas de cultivo para mellorar o proceso de repoboación, centrándose na xeración de individuos termotolerantes. En primeiro lugar, temos ensamblado un transcriptoma de alta calidade, fixemos un inventario de todos os membros da familia das proteínas de choque térmico (HSP) e expuxemos unha liña celular isolada a partir de larvas disgregadas de esturión Atlántico a un choque de calor moderado e severo para identificar xenes sensibles ó calor (Artigo I). Atopamos 76 HSP no transcriptoma de esturión Atlántico, dos cuáis só 16 foron sensibles a polo menos un dos protocolos de choque de calor avalidado, e 5 foron sensibles a ambos choques térmicos idenpendentemene do momento da amostraxe. Utilizando as secuencias dos xens HSP e o trancriptoma de esturión ensamblado no Artigo I como referencia, temos avaliado as diferenzas no transcriptoma hepático en resposta a un choque térmico entre xuvenís criados baixo un réxime de temperatura constante e en réxime fluctuante (Artigo II). Despois de catro semanas de tratamento, os peixes criados en réxime de temperatura fluctuante mostraron entre 2 e 4 veces menos xens diferencialmente expresados en resposta a un novo choque térmico que os peixes criados en réxime de temperatura constante, indicando a súa mellor capacidade para manter a homeostase transcriptómica durante un novo choque térmico. Como xa indicaron os resultados in vitro, moi poucos HSP foron diferencialmente expresados en resposta ó choque de calor no transcriptoma hepático, concretamente hspa1, hspc1 e dnajb4. En xeral, a resposta ao choque térmico no transcriptoma hepático foi máis leve que a resposta in vitro, o que é probablemente consecuencia da activación de mecanismos compensatorios. Estes mecanismos inclúen o sistema neuroendocrino e teñen como consecuencia un aumento da protección dos tecidos e das capacidades termoxénicas, especialmente no peixe criado a temperaturas fluctuantes. Polo tanto, propoñemos que a cría de peixes a temperaturas fluctuantes debe ser incluida no conxunto de novas técnicas empegadas en peixes criados con fins de repoboamento, non obstante, outros protocolos de temperatura deben ser investigados. Dado que unha importante limitación para a avaliación de novas técnicas de cría é a falta dun xenoma de referencia para experimentos de mapeado do transcriptoma, no Artigo III temos ensamblado un xenoma de referencia para o esturión Atlántico, combinando tecnoloxías de secuenciación de curta e longa lectura. O xenoma do esturión Atlántico evidencia por primeira vez a presenza dun evento de duplicación específico de esturión (SR) e independente do peixe-espátula (Polyodon spathula). A presenza de xenes Hox duplicados, xunto con estudos filoxenéticos e de sintenia e os resultados da análise de loci microsatélite suxire que os esturións teñen unha orixe paleotetraploide e que a rediploidización é aínda un proceso activo. En resumo, os resultados presentados nesta tese avanzan no campo da investigación con esturións. Os nosos resultados suxiren que a cría de peixes baixo un réxime de temperatura fluctuante ten un efecto positivo durante un choque térmico subsecuente, pero a influencia de esta nova técnica de cría na supervivencia dos xuvenís tras a súa liberación no habitat a repoboar aínda debe ser avaliada. Contudo, suxerimos que o traballo no futuro ten que estar centrando na optimización dos métodos de cría en programas de repoboación e que o xenoma de referencia debe ser usado.