Gene cloning, purification and characterization of novel hemicellulases for production of tailor made prebiotics and biochemicals

Abstract

The human gut contains billions of microbes which play a key role in human health. They provide us with important short-chain fatty acids, like butyrate, through the fermentation of dietary fibers. A disruption in the gut microbiota have been linked to several diseases, like colorectal cancer, Crohn’s disease, obesity and irritable bowel syndrome. Two of the most important phyla in the gut, Bacteroidetes and Firmicutes, are well equipped with enzymes capable of breaking down complex carbohydrates. Several butyrate producing Firmicutes are generally acknowledged to be beneficial to our health. The growth of these bacteria can be selectively promoted through the use tailored of prebiotics. Complex -mannans, acetylated galactoglucomannan, from Norway spruce (Picea abies) are a new possible prebiotic substrate. This resembles mannans found in our diet, but the complex structure requires a sophisticated degradation system to be utilised.

In this thesis, we have looked into two esterases, FpCE2 and FpCEXX, found in a mannan degrading gen cluster in Faecalibacterium prausnitzii. F. prausnitzii has been shown to utilise the acetylated galactoglucomannan when supplemented in a feeding trial on pigs. The esterases were successfully cloned, expressed and purified. Both enzymes were active on mannan-based substrates, and not on other substrates tested. They show a complementary deacetylation of the substrates. Testing of specificity have revealed that the FpCE2 removes 3-O-, 4-O- and 6-O-acetylations, while the FpCEXX is 2-O specific. The complementary reactivity of These two esterases enables production of tailor made acetylated mannan.

Another part of this thesis was to make mutants of a structurally characterised esterase from Roseburia intestinalis, to look into the possibility of making more specific substrates. The RiCEX esterase removes 2-O-acetylation with high specificity. Mutations made aimed at; A) blocking the galactose pockets found on each side of the active site, or B) open up the catalytic site pocket to possibly fit larger groups, like propionate and butyrate, to the substrate in a transesterification reaction. All mutants were active on the same substrate as the native RiCEX, but we were not able to identify any differences from the native RiCEX on the substrates tested so far. This is subject to further research in our group, and this study has provided several targeted approaches to reveal the potential effects of the different mutants.

Menneskets tarm inneholder millioner av mikrober som spiller en nøkkelrolle i menneskers helse. De gir oss viktige kortkjedede fettsyrer, som butyrat, gjennom gjæring av diettfibre. En forstyrrelse i tarmmikrobiotaens sammensetning har vært knyttet til flere sykdommer, som tarmkreft, Crohns sykdom, fedme og irritabel tarmsyndrom. To av de viktigste phylum i tarmen, Bacteroidetes og Firmicutes, er godt utstyrt med enzymer som kan bryte ned komplekse karbohydrater. Flere butyrat produserende Firmicutes er generelt anerkjent for å være gunstige for vår helse. Vekst av disse bakteriene kan selektivt fremmes gjennom bruk skreddersydde prebiotika. Komplekse -mannaner, som acetylert galactoglukomannan fra Norsk gran (Picea abies) er et nytt mulig prebiotisk substrat. Dette ligner mannan funnet i kostholdet vårt, men den komplekse strukturen krever et sofistikert nedbrytningssystem for å kunne utnyttes.

I denne oppgaven har vi sett på to esteraser, FpCE2 og FpCEXX, funnet i en mannan nedbrytende gen klynge i Faecalibacterium prausnitzii. F. prausnitzii har vist seg å kunne benytte acetylert galaktoglukomannan når det suppleres i et fôringsforsøk på griser. Esterasene ble klonet, uttrykt og renset. Begge enzymer var aktive på mannan baserte substrater, og ikke på andre substrater testet. De viser en komplementær deacetylering av substratene. Test av spesifisitet har vist at FpCE2 fjerner 3-0-, 4-0- og 6-0-acetyleringer, mens FpCEXX er 2-0-spesifikk. Den komplementære aktiviteten til disse to esterasene muliggjør produksjon av skreddersydd acetylert mannan.

En annen del av denne oppgaven var å lage mutanter av en strukturelt karakterisert esterase fra Roseburia intestinalis, for å se på muligheten for å lage mer spesifikke substrater. RiCEX-esterasen fjerner 2-0-acetylering med høy spesifisitet. Mutasjoner ble laget rettet mot; A) blokkering av galaktoselommer funnet på hver side av det aktive setet, eller B) åpne det katalytiske setet for å muligens passe større kjemiske grupper, som propionat og butyrat, til substratet i en transesterifikasjons reaksjon. Alle mutanter var aktive på samme substrat som den native RiCEX, men vi kunne ikke identifisere noen forskjeller fra den opprinnelige RiCEX på de undersøkte substratene hittil. Dette er tema for videre forskning i vår gruppe, og denne studien har gitt flere målrettede tilnærminger for å avdekke de potensielle effektene av de forskjellige mutantene.