Effects of plastic additives on precision cut liver slices (PCLS) from Atlantic cod (Gadus morhua)

Abstract

A vast amount of the plastic we use end up in the ocean and estimates suggest a doubling of plastic in the ocean, to 250 million tonnes by 2025. Plastic contain additives such as phthalates, and these are known to have adverse health effects on living organisms. The additives may leach from products into the environment. Fish liver is a target organ for contaminants, due to its crucial role in biological functions such as metabolic homeostasis and detoxification processes, and precision-cut liver slices (PCLS) is a promising ex vivo system that is utilized within toxicology, using slices of complete liver tissue (Eide et al. 2014). The overall aim of the present study was to determine if exposure to plastic additives, such as phthalates, bisphenol A (BPA) and benzotriazoles (BT), have the potential to promote adverse effects in Atlantic cod (G. morhua). PCLS from six male juvenile Atlantic cod were exposed to 4 concentrations of mono-(2-ethylhexyl)-phthalate (MEHP), BPA and BT both singly and in mixtures ranging from 0.1-100 µM (MEHP), 0.022-22 µM (BPA) and 0.042-42 µM (BT). Histology and transmission electron microscopy (TEM) were used to assess pathological changes and ultrastructure of the exposed liver tissue. Vitellogenin produced by the hepatic tissue were analysed using ELISA, and the transcription levels of selected biomarker genes (vtg1, esr1, cyp1a, scdb, aclya, fabp1a, acox1, hnf4a and cebp) were measured using Q-PCR. A satisfactory assessment of the ultrastructure was not possible due to incomplete fixation of the PCLS with resulting lack of membranes and organelle structure. Histological evaluation did not show any pathological changes. An estrogenic effect was observed with a significant increase in vtg protein synthesis and upregulation of the vtg1 and esr1 genes following exposure to BPA and a mixture of the selected compounds. Hnf4a showed a significant downregulation following mixture exposure, where the BPA were suspected to be the main driver for this response however not inducing a significant downregulation in the single component exposure. A possible antagonistic mixture effect of the selected compounds might be questioned regarding the vtg protein, vtg1 and esr1 as well as a possible additive or synergistic effect regarding the hnf4a, and further investigation is warranted.

En betydelig mengde av plasten som brukes i dag ender opp i havene, og det anslås at vi innen 2025 kan komme til å se en dobling av denne mengden til 250 millioner tonn. Plast inneholder tilsetningsstoffer som for eksempel ftalater, som har vist seg å ha negative helseeffekter på levende organismer. Tilsetningsstoffene som brukes i plast kan lekke fra produktene og ut i miljøet. På grunn av sin avgjørende rolle i biologiske prosesser som metabolisme og avgiftning, er fiskelever et målorgan for forurensende stoffer. Dette gjør ex vivo-systemet med finkuttede intakte leversnitt spesielt lovende innen toksikologi (Eide et al. 2014). Det overordnede målet med dette studiet var å bestemme om eksponering for plastadditiver som ftalater, bisfenol A (BPA) og benzotriazoler (BT) har potensiale til å utløse uønskede helseeffekter hos Atlantisk torsk (G. morhua). For å undersøke dette, ble finkuttede leversnitt fra seks hanntorsk eksponert for 4 ulike konsentrasjoner av mono-(2-ethylhexyl)-ftalat (MEHP), BPA og BT både som enkelt-eksponering og i mikstur i konsentrasjoner på 0.1-100 µM (MEHP), 0.022-22 µM (BPA) og 0.042-42 µM (BT). Histologi og transmisjons elektronmikroskopi ble benyttet for å vurdere eventuelle patologiske forandringer og ultrastrukturen til det eksponerte levervevet. Vitellogeninprotein produsert i levervevet ble analysert med ELISA, og genekspresjonen av enkelte utvalgte biomarkør-gener (vtg1, esr1, cyp1a, scdb, aclya, fabp1a, acox1, hnf4a and cebp) ble målt ved hjelp av Q-PCR. På grunn av ufullstendig fiksering med resulterende tap av membraner og organell-struktur, var det ikke mulig å vurdere leversnittenes ultrastruktur tilfredsstillende. Ved histologisk vurdering ble det ikke funnet patologiske forandringer i levervevet. I leversnittene eksponert for BPA og mikstur, ble det funnet en østrogeneffekt med signifikant økning i vitellogenin-produksjonen og en oppregulering av vtg1 og esr1 i leversnittene. Genekspresjonen av hnf4a ble signifikant nedregulert som følge av mikstureksponeringen. Til tross for at BPA kun grenset mot å gi en signifikant nedregulering av dette genet i enkelt-eksponeringen, antas det at BPA var den viktigste driveren, Det ses en tendens til antagonistisk effekt av stoffene i miksturen når det gjelder vitellogenin-produksjonen og ekspresjonen av vtg1 og esr1, i tillegg til en mulig additiv eller synergistisk effekt på ekspresjonen av hnf4a. Videre undersøkelser av den samlede effekten av stoffene i mikstur anbefales.