Identifisering av β-laktamaser med utvidet spektrum (ESBL og karbapenemaser) blant bakterieisolater fra vannkilder ved bruk av fenotypiske og genotypiske metoder

Abstract

Den globale økningen av antibiotikaresistens (AB) regnes for å være en av de største helsetruslene verden står ovenfor. Verdens helseorganisasjon (WHO) har trukket frem Gram-negative bakterier fra Enterobacteriaceae familien med β-laktamaser med utvidet spektrum (ESBL) og karbapenemaser (CRE) som en av de mest relevante brikkene i dette trusselbilde. Kunnskap står sentralt i kampen mot antibiotikaresistente bakterier (ARB). En holistisk tilnærming, som inkluderer miljøet, er nødvendig for å hemme utviklingen av AR.

Formålet med masteroppgaven var å søke etter tilstedeværelsen av bakterier med ESBL, inkludert karbapenemaser, i ulike vannkilder for å fremme kunnskapen om AR i miljøet.

Vannprøvene ble filtrerte og grodd på «OXOID BrilianceTM ESBL» og «OXOID BrilianceTM CRE» skåler. DNA fra bakterieisolatene ble ekstrahert og amplifisert i en «polymerase chain reaction» (PCR). Det ble benyttet tre multipleks primermikser for å lete etter ESBL gener og to for å detektere karbapenemaser. PCR-produktene ble kjørt på 1 % agarose gelelektroforese for å påvise DNA-bånd. Alle bakterieisolatene ble Sanger-sekvensert. De prøvene med positive DNA-bånd ble helgenomsekvensert med en MinION. Tilslutt ble det utført 13 disk diffusjonstester for å søke etter AR hos de helgenomsekvenserte bakteriestammene.

Det vokste frem åtte bakterieisolater på de selektive skålene. Sanger-sekvenseringen antydet at det vokste frem bakterier fra andre familier (Pseudomonadaceae, Xanthomonadaceae og Alcaligenaceae) enn hva skålene selekterte for (Enterobacteriaceae). Prøve 2 og 3 hadde hvert sitt positive DNA-bånd som kodet for blaCTX-M (gr. 9), og disse to ble prøvene ble helgenomsekvensert. Etter helgenomsekvenseringen kunne det bekrefte at prøve 2 og 3 var Escherichia coli og tilhørte serotype O10:H32, men prøvene var ikke fra samme stamme. Begge E. coli stammene «multidrug» resistente (MDR) og patogen. Prøve 2 var en enteroaggregative E. coli (EAEC), mens prøve 3 kunne kategoriseres som en ekstraintestinale E. coli (ExPEC). Det viktigste antibiotikaresistente genet var et plasmidmediterte blaCTX-M.

Ut fra funnene i oppgaven kunne det konkluderes med at det fantes MDR, patogen E. coli stammer med ESBL i Andedammen som ligger på campusen til Norges miljø- og biovitenskaplige universitet, og plasmidmeditert blaCTX-M hadde mest sannsynlig den størst innvirkningen på den observerte AR.

Antibiotic resistance (AR) is listed as one of the biggest health threats the world is facing. The World Health Organization (WHO) have pointed out Gram-negative bacteria from the Enterobacteriaceae family with extended spectrum β-lactamases (ESBL) and carbapenemases (CRE) as one of the biggest concern when it comes to spreading AR. Knowledge is essential in the war against the AR, and a holistic approach that includes the environment is necessary to reduce the spreading of AR.

The purpose of this thesis was to search for bacteria with ESBL, included carbapenemases, in different water sources to increase knowledge about what role the nature can play in spreading of AR.

The water samples were filtered and grown on OXOID BrilianceTM ESBL and OXOID BrilianceTM CRE petri dishes. DNA from the bacterial isolates was extracted and amplified in a polymerase chain reaction (PCR). It was used three multiplex primermixes to search for ESBL-gens and two to look for carbapenemases. 1 % agarose gelelectrophoresis was used to detect positive DNA-bonds. All the isolates were Sanger-sequenced. The samples with positive DNA-bonds was nanopore sequenced with a MinION. Finally, a disk diffusion test with 13 antibiotic test strips was conducted to search for AR.

Eight isolates grew on the selective petri dishes. The Sanger-sequencing results indicated that bacteria from other families (Pseudomonadaceae, Xanthomonadaceae and Alcaligenaceae) then the Enterobacteriaceae could grow on the selective petri dishes. Sample 2 and 3 each had a positive DNA-bond which encoded for blaCTX-M (gr. 9). These two samples where whole genom sequenced, and after that, it could be stated that sample 2 and 3 were both Escherichia coli and belonged to the serotype O10:H32, but they were not from the same strain. Both off the E. coli stains were multidrug resistant (MDR) and pathogenic. Sample 2 was categorised as an enteroaggregative E. coli (EAEC) while sample 3 was an extra-intestinal pathogenic E. coli (ExPEC). The most important AR gen was a plasmid-meditate blaCTX-M.

It could be concluded MDR, pathogen E. coli stains with ESBL could be found in the «Andedammen» situated the campus of the Norwegian university of life science, and a plasmid-meditate blaCTX-M was most likely the reason for a lot of the observed AR.