Silver nanomaterials in aquatic systems : linking uptake and effects in biota to exposure characterization

Abstract

The potential environmental impacts of engineered nanomaterials (ENMs) have received increased attention over the last decades. While the benefits of the development and use of ENMs are numerous (e.g., improved medical diagnostics, energy saving, improved environmental monitoring and remediation), there is also a risk of environmental release and potential negative effects to biota.

Due to the well-known antibacterial properties of silver, Ag ENMs are amongst the most frequently used ENMs on the market and can be found in, for example, medical applications (e.g., wound dressings, surface coatings of medical devices) and consumer products (e.g., cosmetics, cloths, cleaning agents, and food additives). Silver is known to be highly toxic to aquatic organisms, and the toxicity is usually ascribed to the dissolved species of Ag. The toxicity of Ag ENMs has been extensively studied, however, linking the observed toxicity to exposure characteristics is not always possible due the lack of exposure characterization. Given the tendency of ENMs to aggregate and be removed from the water column by sorption to organisms and sediments, which may in turn be taken up by sediment dwelling organisms, exposure routes to aquatic organisms can include both waterborne and dietary sources.

The overarching aim of this PhD research project has been to increase the understanding of the ways in which nanoparticle properties, and in turn their behaviour in toxicity testing media, influence accumulation and toxicity. To explore these issues, a range of experiments involving four different species (Caenorhabditis elegans, Raphidocelis subcapitata, Salmo salar and Salmo trutta) have been designed to test four interlinked hypothesis:

1. Changes in Ag ion and Ag nanoparticle speciation will cause a time dependent change in the nanoparticle/colloidal fraction in test media exposure solutions. 2. Variation in the size fractions of Ag ion and Ag nanoparticles in test media will result in different bioavailability and bioaccumulation in test organisms. 3. Diet can be a significant route of silver uptake from Ag nanoparticles in fish. 4. Exposure to Ag nanoparticles can cause a nanospecific toxicity component.

Experiments were carried out using AgNO3 as well as a suite of nanomaterials (uncoated Ag NPs, citrate stabilized Ag NPs, a commercial nanosilver suspension Mesosilver, and standard reference materials NM300K, and NM302). The four species studied cover organisms used in standard toxicity tests (Caenorhabditis elegans and Raphidocelis subcapitata), as well as environmentally and economically relevant species (Salmo salar and Salmo trutta).

Studies of the change in size distribution of both Ag ions and Ag NP in toxicity test media showed a change in size fractions, towards the larger particle sizes, with time in all waterborne exposures. Common for all AgNO3 exposures were the higher concentrations of dissolved Ag species (<3 or 10 kDa) relative to the Ag NP exposures. For example, in the highest concentration of AgNO3 in the exposure of R. subcapitata, the initial concentration of dissolved Ag was 24 µg Ag L-1 (98 % of total Ag concentrations), while for Mesosilver and NM300K Ag NPs the concentration the dissolved Ag fraction was 34 % (17 µg Ag L-1) and 1 % (0.3 µg Ag L-1), respectively. The aggregation continued, in all exposure suspensions, throughout the exposure period resulting in a decrease in the NP fraction (defined as > 3 kDa and < 220 nm) of between 13 and 98 % from T = 0 to the end of the exposure, in the Ag NP exposures. For AgNO3, the picture was more complicated, with reductions in the dissolved fraction, combined with aggregation of colloids to larger particles, often leading to a transient increase in colloidal fraction.

For waterborne exposures, comparison of the size fractionation data with bioaccumulation in the different test organisms showed that Ag concentrations in both fish and C. elegans exposed to AgNO3 were higher than after Ag NP exposures. This difference in accumulation of Ag could be correlated with the higher concentration of dissolved Ag species present in the AgNO3 exposures relative to the Ag NP exposures. For NM300K exposures to fish, an absence of dissolved Ag species in exposure media resulted in a lack of systemic uptake of Ag.

In the dietary exposure of fish, both AgNO3 and Ag NP exposures resulted in accumulation of Ag in liver. For two out of the three Ag NPs tested, the Ag concentrations in liver were similar to the levels after exposure to AgNO3 (e.g., mean±s.d; 1.2±0.4 µg Ag/g dry weight and 1.9±0.7 µg Ag/g dry weight, for NM300K and AgNO3, respectively), although the Ag NP showed a much lower uptake than AgNO3 from waterborne exposures. Thus, silver nanoparticles show a potential for dietary uptake and accumulation, however, no negative effects were detected in fish after dietary exposure.

Silver nitrate induced toxicity at lower exposure concentrations than any of the Ag NPs tested, across all organisms. The toxicity of the Ag species was in the order of AgNO3≥ Mesosilver > NM300K > NM3002. The freshwater algae R. subcapitata being the most sensitive (the EC50 values for growth inhibition after 72 h exposure to AgNO3 was 7.09 (95 % CI: 3.83-10.52) µg Ag L-1), and the nematode C. elegans the least sensitive with EC values for 96 h growth one order of magnitude higher than for the algae.

The results provided two lines of evidence that the toxicity observed in the Mesosilver and NM300K Ag NPs exposures could not be explained by the presence of dissolved Ag species (<10 kDa) alone, but rather a nanospecific toxicity or a combination of the two. Comparison of growth inhibition to the dissolved fractions of ions in the NP exposures, showed that for both Mesosilver and NM300K, the growth inhibition was much larger than that seen for AgNO3 groups with similar concentrations of dissolved Ag. Also, the general trend seen in algae growth inhibition over time (i.e., reduced effect on growth over time) was in line with the size fractionation results showing reduced concentrations of in the dissolved Ag and colloidal/NP Ag over time and an increased particulate matter >220 nm (Table 4).

To conclude, aggregation was the net dominant process, resulting in an decrease in NP (> 3 kDa and < 220 nm) and dissolved Ag fractions (< 3 or 10 kDa) and an increase in larger particulate matter (> 220 nm) with time. In the waterborne exposures accumulation, bioavailability and toxicity were linked to the presence of dissolved Ag species in the exposure. Since the results of the present research suggest that acute exposures to Ag NPs are not more toxic than AgNO3, existing risk assessment criteria are unlikely to underestimate the environmental hazards of AgNP. However, the evidence of an AgNP specific component for algae toxicity, combined with the affinity of algae for absorption of AgNP, means that care should be taken in extrapolating this conclusion to chronic exposures.

Menneskeskapte nanomaterialer (ENMs) har vært i søkelyset de siste tiårene på grunn av anvendelsen i industri, teknologi og ikke minst i forbrukerprodukter. Det er mange potensielle fordeler ved utvikling og bruk av ENMs (f.eks. bedret medisinsk diagnostikk, energisparing, forbedret miljøovervåkning og - sanering), men det er også en risiko for utslipp til miljøet og negative effekter i biota. Sølv (Ag) er kjent for sine antibakterielle egenskaper, og av denne grunn er Ag-nanopartikler (Ag NPs) blant de mest anvendte ENMs på markedet. Ag NPs anvendes blant annet innen medisin (f.eks. sårforbinding, overflatebehandling av medisinsk utstyr) og forbrukerprodukter (f.eks. kosmetikk, klær, rengjøringsmidler og tilsetningsstoffer i mat). Sølv er kjent for sin toksisitet overfor akvatiske organismer, og toksisiteten tilskrives vanligvis sølvioner (Ag(I)). Mange studier har tatt for seg opptak og toksisitet av Ag NPs, men relasjonen mellom observert toksisitet og eksponering er ikke alltid tydelig på grunn av manglende karakterisering av nanopartiklene og deres transformeringsprodukter. Grunnet nanopartiklers tendens til å forme aggregater og sorberes til sedimenter, noe som kan føre til opptak i bunndyr, er både vann og diett mulige eksponeringsruter.

Det overordnede målet i denne doktorgraden har vært økt forståelse av hvordan nanopartiklers iboende egenskaper, samt deres oppførsel i testløsning/medium, påvirker akkumulering og toksisitet i organismer. Dette ble undersøkt gjennom en rekke forsøk som involverte fire ulike arter (Caenorhabditis elegans, Raphidocelis subcapitata, Salmo salar (Atlantisk laks) og Salmo trutta (brunørret)) og ble designet til å teste fire sammenflettede hypoteser:

1. Endringer i spesiering av Ag tilstede i AgNO3 og Ag NPs eksponeringene, vil føre til endringer i forekomsten av nanopartikulært/kolloidalt Ag (definert som > 3 eller 10 kDa og < 220 nm) i eksponeringene over tid. 2. Variasjon i forekomsten av løste Ag-komplekser (< 3 eller 10 kda) og nanopartikulært/kolloidalt Ag i test media vil resultere i forskjeller i biotilgjengelighet og akkumulering i testorganismene. 3. Diett kan være en signifikant kilde til opptak av sølv fra Ag NPs i fisk. 4. Eksponering til Ag NPs kan føre til en nanospesifikk toksisitet.

Disse hypotesene ble testet ved bruk av AgNO3, samt en eller flere nanomaterialer (Ag NPs uten overflatebehandling, sitratstabilisert Ag NPs, en kommersiell nanosølvløsning (Mesosilver), og NM300K og NM302, som begge er Ag NPs standard referansematerialer). De fire artene som ble brukt i forsøk dekker organismer som er vanlige å bruke i standardiserte toksisitetstester (C. elegans, R. subcapitata), samt økologisk og økonomisk relevante arter (S. salar og S. trutta).

Resultatene viste en endring i størrelsesfraksjonene av Ag (som reflekterer en endring i spesiering) tilstede i testmedium over tid i alle eksponeringene, med en forskyvning mot større partikler (> 220 nm). Felles for alle AgNO3 eksponeringene var høy konsentrasjon av løst Ag (< 3 eller 10 kDa) i forhold til i eksponeringene med Ag NPs. For eksempel i forsøket med R. subcapitata, var konsentrasjonen av løst Ag i begynnelsen av AgNO3-eksponeringen 24 µg Ag L-1 (98 % av total Ag-konsentrasjon), mens den i eksponeringen med Ag NPs var henholdsvis 34 % (17 µg Ag L-1) og 1 % (0.3 µg Ag L-1) for Mesosilver og NM300K. Aggregering førte til en reduksjon på mellom 13 og 98 % av den nanopartikulære/kolloidale fraksjonen av Ag over tid i eksponeringsløsningene med Ag NPs. For AgNO3 var bildet mer komplisert, med reduksjon i den løste fraksjonen av Ag, kombinert med aggregering av kolloider til større partikler, noe som i en overgangsfase ofte førte til en økt kolloidal fraksjon.

Ag-konsentrasjonen i fisk ved vanneksponering til AgNO3 var høyere enn ved eksponering til Ag NPs. Denne forskjellen i bioakkumulering av Ag var korrelert med den høyere konsentrasjonen av løst Ag (< 3 eller 10 kDa) i AgNO3-eksponeringen sammenlignet med Ag NPs-eksponeringen. Det mest ekstreme eksemplet var NM300K Ag NPs, hvor det ikke ble påvist systemisk bioakkumulering av Ag, noe som kunne kobles til fraværet av løst Ag i eksponeringsmediet.

Ved dietteksponering av fisk, førte både AgNO3 og Ag NPs til akkumulering av Ag i lever. To av de tre Ag NPs som ble testet førte til akkumulering av Ag til samme nivåer som ved eksponering til AgNO3 (f. eks., gjennomsnitt ± standard avvik; 1.2 ± 0.4 µg Ag/g tørrvekt og 1.9 ± 0.7 µg Ag/g tørrvekt for henholdsvis NM300K og AgNO3). På tross av dokumentert opptak ble det ikke påvist toksisitet.

Toksisitet ble indusert av AgNO3 ved lavere Ag-konsentrasjoner enn noen av de testede Ag NPs, uavhengig av organisme. Toksisiteten av de ulike formene for Ag kunne rangeres AgNO3 ≥ Mesosilver > NM300K > NM302. Ferskvannsalgen R. subcapitata var den mest sensitive organismen (EC50-verdier for veksthemning etter 72 t eksponering til AgNO3 var 7.09 (95 % CI: 3.83-10.52) µg Ag L-1), mens C. elegans var den minst sensitive med EC50-verdier for 96 h vekst en størrelsesorden høyere enn for algen. I alle forsøkene, uavhengig av organisme, ble det observert en endring i størrelsesfraksjonene av Ag over tid. Aggregering var den netto dominerende prosessen, noe som resulterte i reduksjon i både nanopartikulært/kolloidalt (> 3/10 kDa og < 220 nm) og løst (< 3/10 kDa) Ag, samt en økning i større Ag-partikler (> 220 nm) over tid. Akkumulering, biotilgjengelighet og toksisitet ved vanneksponering til sølv kunne kobles til konsentrasjonen av løst Ag i eksponeringsmedium. I tillegg indikerte resultatene fra algestudiet en nanospesifikk komponent i toksisiteten av Mesosilver.