Chromatin accessibility after inhibition of enhancer of zeste homolog 2 (Ezh2) in zebrafish embryos

Abstract

The thesis is a part of a Centre of Excellence Centre for Environmental Radioactivity (CoE CERAD) project, focusing on trans-generational studies of low-dose gamma-irradiation using zebrafish as a model organism. As a part of the epigenetic toolbox, Assay for Transposase-Accessible Chromatin (ATAC-seq) is established using a known epigenetic inhibitor (Ezh2i), PF-06726304 acetate, in a pilot study with the hypothesis that PF-06726304 acetate would induce a decline in H3K27me3 marks in chromatin, correlated with condensed chromatin and silent genes. Subgoals were to establish methods for manual dechorionation and protocols for enzymatic dechorionation, establish methods for ATAC-seq library generation and clean-up, and establish a bioinformatic pipeline for preliminary ATAC-seq analysis. The ATAC-seq results from the treatment of PF-06726304 were validated with Western Blot and Chromatin Immunoprecipitation. The thesis shows that low-dose exposure to the Ezh2 inhibitor, PF-06726304 acetate, indeed induces chromatin reorganization. Our results suggest that a GUI tool for the Analysis and Visualization of ATAC-seq data (GUAVA) can be used as a primary dataset analysis tool, but that more thorough post-analysis is necessary.

Denne oppgaven er en del av et prosjekt under Senter for radioaktivitet, mennesker og miljø (SFF CERAD), med fokus på transgenerasjonsstudier av lavdose gamma-bestråling ved bruk av sebrafisk som modellorganisme. Som en del av den epigenetiske verktøykassen er metoden, «Assay for Transposase-Accessible Chromatin (ATAC-seq)» etablert ved bruk av en kjent epigenetisk inhibitor (Ezh2i), PF-06726304 acetat, i en pilotstudie med hypotesen om at PF-06726304 acetat ville indusere en nedgang i H3K27me3 i kromatin, som har sammenheng med pakket sammen kromatin og inaktive gener. Delmål for oppgaven var å etablere en metode for manuell dechorionering, samt å etablere en metode for mer robust enzymatisk dechorionering, etablere metoder for rensning av ATAC-seq bibliotek, og etablere bioinformatisk nedstrømsanalyse for ATAC-seq analyse. ATAC-seq resultatene etter eksponering med PF-06726304 ble validert med Western Blot and Kromatin Immunopresipitering. Oppgaven viser at eksponering med lav dose til Ezh2-inhibitoren, PF-06726304 acetat, faktisk promoterer kromatinomorganisering. Resultatene tyder på at et GUAVA, som er et verktøy med grafisk brukergrensesnitt for analyse og visualisering av ATAC-seq-data (GUAVA) kan brukes som et foreløpig analyseverktøy, men at en grundigere analyse i etterkant er nødvendig.