Intestinal microbiota, red meat, and colorectal tumours in dogs

Abstract

Tarmens mikrobiota består av et rikt nettverk av mikrober som har betydning for vertens fysiologi, og således helse og velvære. Mikrobiotaen påvirkes av diettens sammensetning av makronæringsstoffer (karbohydrater, proteiner, fettstoffer og ikke-fordøyelige karbohydrater). Hos mennesker er høyt inntak av rødt kjøtt, f.eks. biff, og lavt inntak av fiber, forbundet med økt risiko for kolorektal kreft, som utvikler seg fra premaligne adenomer. Dette kan være assosiert med bakteriene i tykktarmen. Fôring med kjøttbasert kost kan føre til at metabolitter som produseres fra bakterier akkumuleres i tykktarmen. Noen av disse metabolittene kan ha kreftfremkallende virkning, mens andre kan ha en kreftbeskyttende effekt. Det er påvist at mennesker med kolorektal adenom og karsinom har en annen sammensetning av tarmmikrobiota sammenliknet med friske personer. I motsetning til mennesker utvikler hunder sjelden kolorektale tumorer og kreft. Hunder spiser alt fra tørrfôr med høy andel karbohydrater, til kjøttbaserte dietter med høyt protein og fettinnhold. Det er ikke blitt undersøkt hvorvidt hunder med kolorektale svulster har en annen sammensetning av tarmbakterier sammenliknet med friske hunder. Derfor bestemte vi oss for å: 1) evaluere innflytelsen av kokt kjøttdeig på tarmens mikrobiota og metabolitter hos friske hunder, og 2) å karakterisere tarmmikrobiota hos hunder med kolorektale svulster (polypper, adenomer og karsinomer).

Elleve friske privat-eide hunder ble inkludert i en fôringsstudie, hvorav åtte fullførte alle diettperioder. Hundene ble fôret med et kommersielt tørrfôr (CD) de første to ukene (CD1), bestående av 27,1 g/100 g tørrstoff (DM) proteiner, 16,3 g/100 g DM lipider, 48,3 g/100 g DM nitrogen- fri ekstrakt (NFE) og 10,4 g/100 g DM fiber (ikke-stivelse polysakkarider). Deretter fikk hundene en blanding av CD og kokt kjøttdeig (MB) i tre uker, der MB-innholdet ble økt gradvis hver uke på bekostning av CD. Mengden MB som ble gitt hundene hver uke, ble beregnet individuelt ut fra energibehovet og var 25% (lav kjøttmengde, LMB), 50% (moderat kjøttmengde, MMB) og 75% (høy kjøttmengde, HMB), av hundenes totale energibehov. Innholdet av makronæringsstoffer i HMB var som følger: 46,2 g/100 g DM proteiner, 33,1 g/100 g DM lipider, 15,6 g/100 g DM NFE og 3,4 g /100 g DM fiber. Til slutt, ble hunder fôret med CD (CD2). HMB førte til endringene i fekal mikrobiota og metabolitter i fæces, og disse endringene var i stor grad reversible. Endringene bestod av redusert Shannon diversitetsindeks, høyere relativ andel av en operativ taksonomisk enhet (OTU) tilknyttet arten Clostridium hiranonis og lavere relativ andel av en OTU tilknyttet arten Faecalibacterium prausnitzii, samt økt fekal pH og økte nivåer av isovaleric syre. HMB førte også til høyere fekale nivåer av deoksycholic syre (DCA), ursodeoxycholic syre (UDCA) og taurinkonjugerte gallesyrer, sammenlignet med CD1 og/eller CD2. Nivåene av DCA ble reversert til opprinnelige nivåer når hundene igjen ble fôret med CD. Siden C. hiranonis har evnen til å omdanne primære gallesyrer til sekundære gallesyrer, kan den høye mengden DCA i fekalprøver av hunder som får HMB, være forårsaket av en samtidig proliferasjon av denne bakterien. Høyt proteininnhold i dietten kan forklare økt mengde av proteolytiske bakterier, slik som Clostridiaceae spp. Den antibakterielle effekten av gallesyrer kan forklare lavere Shannon diversitetsindeks og reduserte nivåer av gallefølsomme bakterier, slik som Faecalibacterium prausnitzii. Det ble ikke påvist store endringer i mikroiota og metabolitter i fæcesprøver fra hunder som fikk lavere mengde kjøtt (LMB og MMB).

Fæces og slimhinne-assosiert mikrobiota ble undersøkt hos hunder diagnostisert med kolorektale epiteliale svulster (polypper, adenomer og karsinom). Sammensetningen av den fekale mikrobielle populasjonen hos hunder med svulster (n = 10) ble karakterisert ved hjelp av 16S rDNA. Denne populasjonen var annerledes enn den fra kontrollhundene (n = 13). Hos hunder med svulster var det oligotyper tilknyttet Enterobacteriaceae, Bacteroides, Helicobacter, Porphyromonas, Peptostreptococcus og Streptococcus, som kan ha patogene egenskaper, samt lavere andel av Ruminococcaceae, Slackia, Clostridium XI og Faecalibacterium, som er butyratproduserende bakterier. En høyere andel av potensielt patogene bakterier, samt reduksjon av butyratproduserende bakterier, har også blitt observert hos mennesker med kolorektale adenomer og karsinomer. Det var ingen forskjell i sammensetningen av slimhinne-assosiert tarmmikrobiota, basert på enten 16S rDNA eller 16S rRNA, i tumorvev (n = 8) og ikke-tumorvev (n = 5). Likevel så det ut som andelen levende, potensielt aktive bakterier, var høyere i ikke-tumorvev sammenlignet med tumorvev. Disse bakteriene inkluderte Slackia, Roseburia, uklassifisert Rominococcaeceae, uklassifisert Lachnospiraceae og Oscillibacter, hvorav noen av disse er butyratproduserende bakterier. Hvorvidt intestinal mikrobiota, inkludert fekal og slimhinne-assosiert mikrobiota, er tilstede før, snarere enn på grunn av svulstutvikling hos disse hundene, er imidlertid ukjent.

Tilsammen gir disse studiene ny kunnskap om samspillet mellom diett og tarmmikrober, samt sammensetningen av tarmmikrobiota hos hunder med kolorektale tumorer. Våre resultater viser at store endringer i matens innhold av makronæringsstoffer er nødvendige for å endre den fekal mikrobiotasammensetningen hos hunder. Hvorvidt en endret fekal mikrobiota er dysbiotisk og bidrar til en høyere risiko for å utvikle kolorektal kreft, som antas å forekomme hos mennesker, ble ikke undersøkt i dette arbeidet. Vi identifiserte imidlertid en annen fekal mikrobiota profil hos hunder med kolorektale svulster sammenlignet med de friske, noe som indikerer at dysbiose kan spille en rolle under utviklingen av tarmkreft. Våre observasjoner gir kunnskap som kan være nyttig for fremtidig hypotesegenererende forskning, som undersøker konsekvensene av dietter på tarmens helse, mikrobenes rolle i hundens utvikling av tarmkreft og evt. bruk av mikrobielle biomarkører for å diagnostisere og overvåke sykdomsutvikling.

The intestinal microbiota consists of a dense community of microbes that provide several important key factors in host physiology, thus contributing to health and wellbeing. The microbiota is influenced by the diet’s composition of macronutrients (carbohydrates, proteins, fats, and non-digestible carbohydrates). In humans, high intake of red meat, such as beef, and low intake of fibre is associated with an increased risk of colorectal cancer, which develops from pre-malignant adenomas. This may be associated with the action of colonic bacteria. One consequence of feeding a meat-based diet may be accumulation of bacteria-derived metabolites in the colon. Some of these metabolites may have carcinogenic potential, while others are cancer-protective. It has been demonstrated that humans with colorectal adenoma and carcinoma have a different intestinal microbiota composition than that of healthy subjects. In contrast to humans, dogs rarely develop colorectal tumours and cancer. Their diets range from dry food containing considerable amounts of carbohydrates to meat-based diets with high protein and fat content. Whether dogs with colorectal tumours have a distinct intestinal microbial profile potentially involved in the development of disease, has not previously been investigated. We therefore decided to: 1) evaluate the influence of beef on the faecal microbiota and metabolites in healthy dogs, and 2) to characterise the intestinal microbiota in dogs with colorectal tumours (polyps, adenomas, and carcinomas).

Eleven healthy client-owned dogs were included in a dietary intervention study, of which eight completed all the dietary periods. Dogs were adapted to a commercial dry food (CD) for the first two weeks (CD1), consisting of 27.1 g/100 g dry matter (DM) proteins, 16.3 g/100 g DM lipids, 48.3 g/100 g DM nitrogen-free extract (NFE) and 10.4 g/100 g DM fibre (non-starch polysaccharides). Thereafter, the dogs received a mixture of CD and boiled minced beef (MB) for three weeks, with the MB content gradually increased in weekly increments at the expense of CD. The amount of MB given each week was calculated to provide 25% (low minced beef, LMB), 50% (moderate minced beef, MMB), and 75% (high minced beef, HMB) of the dogs’ total energy requirement. The content of macronutrients in HMB was as follows: 46.2 g/100 g DM proteins, 33.1 g/100 g DM lipids, 15.6 g/100 g DM NFE, and 3.4 g/100 g DM fibre. Finally, dogs were reintroduced to CD (CD2). The HMB-induced changes in the faecal microbiota and metabolites, were largely reversible. These changes included a reduced Shannon diversity index, a higher relative abundance of an operational taxonomic unit (OTU) affiliated with the species Clostridium hiranonis and lower relative abundance of an OTU affiliated with the species Faecalibacterium prausnitzii, a higher faecal pH, and elevated levels of isovaleric acid. The HMB also induced higher faecal quantities of deoxycholic acid (DCA), ursodeoxycholic acid (UDCA), and taurine-conjugated bile acids as compared to CD1 and/or CD2. The levels of DCA were reversed to original levels when dogs were reintroduced to CD. Since C. hiranonis has the capability to convert primary bile acids into secondary bile acids, the high quantity of DCA in faecal samples of dogs fed HMB, may be caused by the concomitant proliferation of this bacteria. High protein content in the diet may explain the increased abundance of proteolytic bacteria, such as Clostridiaceae spp. The antibacterial effect of bile acids may explain the lower Shannon diversity index and decreased levels of bile-sensitive bacteria such as Faecalibacterium prausnitzii. No major changes in the faecal microbiota and metabolites were observed in dogs fed diets with a lower content of beef (LMB and MMB).

The faecal and mucosa-associated microbiota were examined in dogs diagnosed with colorectal epithelial tumours (polyps, adenomas, and carcinoma). The faecal microbial community structure in dogs with tumours (n=10) was determined by 16S rDNA profiling and differed from that of control samples (n=13). It was distinguished by oligotypes affiliated with Enterobacteriaceae, Bacteroides, Helicobacter, Porphyromonas, Peptostreptococcus and Streptococcus, which are potentially pathogenic, as well as lower abundance of Ruminococcaceae, Slackia, Clostridium XI, and Faecalibacterium, which are butyrate- producing bacteria. A higher abundance of potentially pathogenic bacteria, as well as a reduction of butyrate-producing bacteria, has also been observed during the development of colorectal adenoma and carcinoma in humans. The overall community structure and populations of mucosal bacteria were not different, based on either the 16S rDNA or the 16S rRNA profile in tumour tissue (n=8) vs. adjacent non-tumour tissue (n=5). However, the proportion of live, potentially active bacteria appeared to be higher in non-tumour tissue than tumour tissue, and included Slackia, Roseburia, unclassified Ruminococcaeceae, unclassified Lachnospiraceae and Oscillibacter, some of which are major butyrate producers. Whether the intestinal microbiota, including faecal and mucosa-associated microbiota, is present prior to, rather than because of, tumour development in these dogs, is, however, unknown. Together, these studies provide new knowledge on the interplay between diet and intestinal microbes, as well as the intestinal microbiota composition in dogs with colorectal tumours. Our results suggest that large shifts in the dietary mixture of macronutrients are necessary in order to alter the faecal microbiota composition in dogs. Whether an altered faecal microbiota is dysbiotic and contributes to a higher risk for developing colorectal cancer, which is believed to occur in humans, was not investigated in this study. We did however; identify a different faecal microbiota profile in dogs with colorectal tumours compared with that of healthy controls, indicating that intestinal dysbiosis may be part of the canine colorectal carcinogenesis. Our observations provide knowledge that may useful for future hypothesis-generating research investigating the consequences of diets on canine gastrointestinal health, the role of microbes in canine tumorigenesis, and the use of microbial biomarkers for screening purposes.