Screening and characterization of bacteriocins produced by lactic acid bacteria against Lactococcus garvieae

Abstract

Infectious diseases caused by bacteria have ravaged humankind multiple times in history until the discovery of antibiotics. Now, several decades later, bacteria resistant to nearly all antibiotics have been reported due to the overuse and misuse of the latter. To remediate the alarming situation and avoid a disastrous future, novel approaches to antibiotics must be investigated. Bacteriocins are good candidates for the treatment of bacterial infections for several reasons. First, they have a narrow spectrum of activity compared to antibiotics, which limit the selective pressure for resistance to the pathogens instead of all the commensal bacteria. Bacteriocins are also non-toxic to humans since many are already used as food preservatives. Finally, they could be effective to fight antibiotic resistant bacteria due to their different killing mechanism. The purpose of this study was to isolate and characterize lactic acid bacteriocins that could inhibit the fish and emerging human pathogen Lactococcus garvieae. To accomplish that goal, 50 samples of fermented fruits and vegetables were screened against L. garvieae by using a “sandwich overlay” method. The potential bacteriocin-producers were then identified by 16S rRNA gene sequencing and REP PCR profiling. To characterize the antimicrobials produced by the isolates, proteinase K and heat stability tests were conducted, and the inhibition spectrum was determined. Based on the results of these experiments, seven different strains were selected, and their genomes were sequenced on an Illumina Miseq system. The sequenced genomes were then uploaded on BAGEL4 to look for bacteriocin genes. The results showed that each genome contained putative bacteriocin genes and in some cases, more than one bacteriocin was identified. In addition, the observation that the identified bacteriocins belonged to different classes illustrates well the diversity of lactic acid bacteriocins. The last experiment was the purification of the most relevant bacteriocin in respect to the purpose of the study. In that context, the bacteriocin from Enterococcus thailandicus was purified by ammonium sulfate precipitation followed by one reverse-phase chromatography step. The molecular mass was determined to be 6312 Da by MALDI-TOF MS, which confirms that the purified bacteriocin was the circular thaiocin 1. The results of the study suggest the use of thaiocin 1 from E. thailandicus to control the growth of L. garvieae in fish farming.

Infeksjonssykdommer forårsaket av bakterier har herjet menneskeheten flere ganger i historien, til oppdagelsen av antibiotika. Nå, flere tiår senere ser det ut som at bakteriene har kontrollen igjen grunnet observasjoner av bakterier som er resistente mot alle typer antibiotika. Overforbruk og misbruk av sistnevnte førte til den resistens-krisen i dag. For å rette opp den alarmerende situasjonen og unngå en katastrofal fremtid, må nye tilnærminger til antibiotika undersøkes. Bakteriociner er gode kandidater for behandling av bakterielle infeksjoner av flere grunner. For det første har de et smalt spekter av antimikrobiell aktivitet sammenlignet med antibiotika, noe som begrenser det selektive trykket for resistens mot patogener istedenfor alle kommensale bakterier. Bakteriociner er også ikke-giftige for mennesker, ettersom mange er allerede brukt som mat konserveringsmidler. Til slutt kan de være effektive for å bekjempe antibiotikaresistente bakterier på grunn av deres ulike drepemekanisme. Hovedmålet med denne oppgaven var å isolere og karakterisere bakteriociner produsert av melkesyrebakterier, som kunne hemme veksten av fiskepatogenen og fremvoksende humanpatogenen Lactococcus garvieae. For å oppnå målet ble 50 prøver av fermentert frukt og grønnsaker screenet mot L. garvieae ved å bruke en "sandwich overlay" metode. De potensielle bakteriocin-produsentene ble deretter identifisert med 16S rRNA-gen-sekvensering og REP-PCR-profilering. For å karakterisere de antimikrobielle forbindelsene produsert av isolatene ble proteinase K og varmestabilitet tester utført, og inhiberingsspekteret ble undersøkt. Basert på resultatene av disse undersøkelsene ble det valgt syv forskjellige stammer, og deres genom ble sekvensert på et Illumina Miseq-system. De sekventerte genomene ble deretter lastet opp på BAGEL4 for å lete etter bakteriocin-gener. Resultatene viste at hvert genom inneholdt putative bakteriocin-gener, og i noen tilfeller ble mer enn ett bakteriocin identifisert. I tillegg tilhørte de ulike bakteriocinene forskellige klasser, noe som illustrerer mangfoldet av bakteriociner fra melkesyrebakterier. Det siste forsøket var rensingen av det mest relevante bakteriocinet i forhold til formålet med studien. I den sammenhengen ble bakteriocinet fra E. thailandicus renset ved ammoniumsulfatutfelling etterfulgt av et omvendt-fase kromatografi trinn. Molekylmassen ble bestemt til å være 6312 Da ved MALDI-TOF MS, som bekrefter at det rensede bakteriocinet var den sirkulære thaiocin 1. Resultatene av studien oppfordrer bruken av thaiocin 1 fra E. thailandicus for å hemme veksten av L. garvieae i fiskeoppdrett.