Sammenlikning av molekylære metoder for genotyping av humant papillomavirus

Abstract

Vedvarende infeksjon av en høyrisiko genotype av humant papillomavirus (HPV) er en nødvendig forutsetning for utvikling av livmorhalskreft. I 2009 ble vaksinasjon mot viruset innført som en del av det norske barnevaksinasjonsprogrammet. For å undersøke effekten av vaksinen, skal de epidemiologiske forandringene av HPV i den norske befolkningen overvåkes. Denne oppgaven har til hensikt å sammenlikne molekylærbiologiske metoder for genotyping av HPV, samt å bestemme hvilken av oppgavens metoder som er best egnet for genotyping i prøver med multiple infeksjoner. Blandingsprøver av HPV 16 og HPV 18plasmider samt 20 HPV-positive urinprøver fra norske uvaksinerte kvinner ble amplifisert med polymerase kjedereaksjon (PCR) med modifiserte generelle primere (MGP), før genotyping ved bruk av smeltepunktsanalyse, luminex-hybridiseringsteknologi, Sangersekvensering og nestegenerasjons sekvensering (NGS). PCR-reaksjonene for klargjøring til Sanger-sekvensering og bibliotekspreparering for NGS ble etablering og optimalisering ved bruk av HPV 16 og HPV 18 plasmider. Biblioteksprepareringen for NGS ble utført ved PCRbaserte metoder og ved ligeringsmetoder. Resultatene viser at multipleks PCR med MGP ikke er en optimal reaksjon, da enkelte genotyper amplifiseres med bedre effektivitet enn andre. Videre er smeltepunktsanalyse er en uegnet genotypingsmetode da flere av genotypene har svært lik smeltetemperatur. Sanger-sekvensering klarer ikke å påvise multiple infeksjoner. Luminex-hybridisering påviser multiple infeksjoner, men ser ut til å ha dårlig reproduserbarhet. NGS påviste multiple infeksjoner og ser foreløpig ut til å gi de beste resultatene blant disse metodene. Foreløpige resultater indikerer at PCR-baserte metode for bibliotekspreparering er mer effektiv enn ligeringsmetode. NGS ble utført på MiSeq, Illumina, hvor henholdsvis 1 024 572 og 750 930 sekvenser generert fra HPV 16 og HPV 18 positive kontroller, ble genotypet til den gjeldende genotypen.

Persistent infection of a high-risk type of Human Papillomavirus (HPV) is a necessary cause for the development of cervical cancer. In 2009 a vaccine targeting the virus was introduced in the Norwegian childhood humanisation program. To investigate the effect of the vaccine, the epidemiological changes of HPV in the Norwegian population are being monitored. The aim of this thesis is to compare molecular biological methods for genotyping of HPV in order to identify which methods is best suited for genotyping in samples with multiple infection. Samples with a mix of HPV 16 and HPV 18 plasmids and urine samples from Norwegian unvaccinated women were amplified with polymerase chain reaction (PCR) by the use of Modified General Primers (MGP), before genotyping with high resolution melt analysis (HRM), Luminex hybridisation, Sanger sequencing and Next Generation Sequencing (NGS). The PCR reactions for preparing for Sanger sequencing and library preparations for NGS were designed and optimised by use of HPV 16 and HPV 18 plasmids. Library preparations for NGS were made by PCR-based and ligation methods. Results show that multiplex PCR with MGP is not an optimal reaction as some genotypes amplify with a better efficiency than others. HRM was found to be incapable of genotyping, as different genotypes have similar melting temperature. Sanger sequencing cannot detect multiple infections. The Luminex hybridisation system does detect multiple infections but has weak reproducing abilities. NGS detects multiple infections and appears to be the most successful of these methods for genotyping of HPV in samples with multiple infections. Preliminary results indicate that the PCR-based method is the most efficient method for NGS library preparations. NGS was run on MiSeq, Illumina, where respectively 1 024 572 and 750 930 sequences generated from HPV 16 and HPV 18 positive controls, mapped to the reference genome.