Prosessmålingsteknologi for proteinhydrolysater : FTIR-spektroskopi, SEC og OPA-metode

Abstract

Enzymatisk proteinhydrolyse av restråstoff fra kjøtt-, fisk- og meierindustrien, med formål om å produsere spiselige peptidprodukter, er en voksende industri. For å kunne utnytte potensialet til disse proteinene er det viktig at råstoffet behandles riktig. I dag gjøres det målinger av sluttproduktet for å måle hydrolysegrad ved bruk av OPA-metoden. For å få bedre sluttprodukter er det viktig å ha en kontinuerlig kontroll av proteinkvaliteten underveis i prosessen. Det er ønskelig å bruke FTIR-spektroskopi til dette formålet da metoden har vist seg å kunne detektere endringen i proteinets struktur underveis i en hydrolyseprosess. For å få ytterligere informasjon om proteinhydrolysatet er det også ønskelig å undersøke om gjennomsnittlig molekylvekt beregnet ved bruk av SEC er en aktuell metode. Målet med denne oppgaven var å sammenligne FTIR-spektroskopi og OPA-metoden for analyse av proteinhydrolysat ved bruk av PLS-regresjon samt å sammenligne SEC og OPA-metoden. Prosjektet hadde også som formål å undersøke reproduserbarheten til SEC og OPA-metoden.

Til sammenligning av analysemetodene ble hydrolysat fra myseproteinkonsentrat, melkepulver, helmelkspulver og mysepulver hydrolysert ved bruk av Flavourzyme og Alcalase over en periode på 3 timer brukt.

Beregnet hydrolysegrad for proteinhydrolysatene, ved bruk av OPA-metoden, viste en økende hydrolysegrad etter hvert som hydrolysetiden økte. Denne økningen var svært ujevn. En stabilitetstest av OPA-reagenset viste at reagenset var ustabilt innenfor anbefalt brukstid, som kan ha spilt inn på resultatene. Ved bruk av Flavourzyme ble det oppnådd dobbelt så høy hydrolysegrad enn ved bruk av Alcalase. Beregnet gjennomsnittlig molekylvekt plottet som funksjon av hydrolysetid viste en jevn minkende kurve. Resultatene fra FTIR-spektroskopi av proteinhydrolysatene viste at det var mulig å detektere formasjon av frie karboksylat- og aminoterminaler underveis i hydrolyseprosessen. Nedbrytningen av proteinene og peptidene ved amid I og II båndene var noe kompleks å tolke.

OPA-metoden viste seg å være en lite reproduserbar metode (%RTSD=14-30 (6 målinger innfor én dag) og 14-30 (6 målinger over 6 dager)). For SEC ble de relative standardavvikene beregnet til 1-7% for 6 målinger på samme dag. På grunn av feil under forsøket over 6 dager er det ikke mulig å konkludere med hvorvidt metoden er reproduserbar. FTIR-spektrene viste god korrelasjon med målt absorpsjon ved OPA-metoden (R2=0.93) og gjennomsnittlig molekylvekt (R2=0.91). SEC viste moderat god korrelasjon med målt absorpsjon ved OPA-metoden (R2=0.85). Korrelasjonen mellom hydrolysegrad og FTIR-spektrene og SEC var ikke god (R2=0.63 og 0.65). Dette skyldtes trolig analysen av mengde protein i prøvene.

Enzymatic protein hydrolysis of by-products from the fish, meat and dairy industry, with the purpose to produce eatable peptide products, is a growing industry. It is crucial that the by-products are treated right to fully utilize the potential of the proteins. Today the OPA-method is used to perform measurements on the end products to determine the degree of hydrolysis. To obtain better end products it is important to continuously monitor the protein quality during the hydrolysis process. FTIRspectroscopy has turned out to be a method that can detect changes in the protein structure. Thus, it is desirable to use FTIR-spectroscopy for this purpose. To get ulterior information about the protein hydrolysates, it is desirable to investigate the possibilities of using average molecular weight obtained by SEC as a process monitoring parameter. The aim of this thesis was to compare FTIR-spectroscopy with the OPA-method, and SEC with the OPA-method for analysis of protein hydrolysates. This comparison was carried out by calculating PLSregression models. An additional aim was to investigate the reproducibility of SEC and the OPAmethod. For the comparison, hydrolysates from whey protein concentrate, milk powder, whole milk powder and whey powder hydrolyzed with Flavourzyme and Alcalase over a period of 3 hours, were used. The results from the OPA-analysis showed increasing degree of hydrolysis as the hydrolysis time increased. This increase was unsteady and can be a result of the OPA-reagent being unstable within the recommended time for usage. By using Flavourzyme there was obtained a higher degree of hydrolysis than by use of Alcalase. Average molecular weight plotted as a function of hydrolysis time showed a steadily decreasing curve. The results from the FTIR-spectroscopy of the protein hydrolysates showed that it was possible to detect the formation of free carboxylate- and amino terminals during the hydrolysis process. Digestion of proteins and peptides, showed by the amid I and II bands, was complex and hard to interpret. The OPA-method turned out to not be a reproducible method (%RSTD=14-30 (for 6 measurements intraday) and 14-30 (for 6 measurements interday)). For SEC the percentage relative standard deviation was calculated to 1-7% from 6 intraday measurements. Because of errors occurring during the interday measurements, it is not possible to conclude whether the method is reproducible. The FTIR-spectra showed a good correlation with the measured absorptions obtained by the OPAmethod (R2=0.93) and average molecular weight (R2=0.91). SEC showed a moderate good correlation with the measured absorptions obtained by the OPA-method (R2=0.85). The correlation between the degree of hydrolysis and FTIR-spectra and SEC was not good (R2=0.63 and 0.65). This is most likely due to errors which arised during the analysis for the protein determination.