Functional characterization of the germination receptors in the spore-forming species Bacillus licheniformis

Abstract

The food industry experience extensive losses worldwide due to food spoilage caused by microbial activity. Endospore-forming bacteria, such as members of the genera Bacillus and Clostridium, are becoming increasingly problematic to the food industry due to a growing consumer demand for mildly processed foods with a fresh quality. Bacterial endospores (spores) exist in a morphological unique life state in which they are extremely resistant to environmental insults (e.g. nutrient deprivation, heat, irradiation and harmful chemicals). Therefore contaminating spores will readily survive food-processing temperatures of ≤ 100 °C, which kills most vegetative bacteria. The spore-former Bacillus licheniformis is commonly isolated from both ingredients and the finished food products, and because of its high capacity to produce and excrete enzymes it is an important spoilage bacterium. It has also been reported to cause food poisoning related to the consumption of meat and vegetable dishes, rice dishes and infant formula. Spore germination is the essential step that allow spore-related food spoilage or disease, and coincidentally, it can be the key to spore elimination. There is currently little knowledge about spore germination in B. licheniformis despite its economic importance. The main goal of this thesis work was therefore to expand our understanding of how germination is triggered in B. licheniformis spores. Germination is generally triggered by the activation of germination receptors present in the inner membrane of the spore by specific nutrient molecules (often amino acids). This will initiate the cascade of events transforming the spore into a vegetative cell. The germination receptors are present in most endospore-forming bacteria, and are encoded by closely related gerA family genes. The work described in this thesis characterize the germination receptors found in B. licheniformis ATCC14580/DSM13 encoded by the gerA, gerK, ynd operons and the yndF2 orphan gene. By screening 20 different L-amino acids, we showed that L-alanine, L-cysteine or L-valine induced the strongest germination response in B. licheniformis spores. We found that both the GerA and Ynd germination receptors were necessary to induce an effective germination response to the tested L-amino acids, indicating cooperative interaction between these receptors. The GerA germination receptor was found to be essential for L-amino acid-induced germination, as any disruption in this operon completely abolished germination. The Ynd germination receptor contributed substantially to germination but was not essential, the germination efficiency was reduced by 40-60 % when the ynd operon was disrupted. GerK did not have a function in L-amino acid-induced germination, however, this receptor was necessary for the weak glucose-induced germination we observed. A closer study of the Ynd receptor was initiated, as the ynd operon differ from the most common, tricistronic operon organization of the gerA family genes, encoding the receptor’s A-, B- and C subunit. The ynd operon in B. licheniformis is pentacistronic, encoding the A-, B3-, B2-, C- and B1 subunit, respectively, and this atypical organization of the Ynd operon is highly conserved in B. licheniformis. In this study, we showed that deleting of one or two of the B subunits rendered the receptor non-functional. However, the Ynd receptor was capable of functioning when all three B subunits were deleted, demonstrating that the A subunit was sufficient for the cooperative interaction between Ynd and GerA. High pressures (80 MPa–600 MPa ≈ 790–5900 atm) induce spore germination in Bacillus spores. Moderately high pressures (80-300 MPa) induce germination by activating the germination receptors, however, different germination receptors display different high-pressure responsiveness. In B. licheniformis spores, the Ynd germination receptor contributed the most to high pressure-induced germination, unlike what was observed for nutrient-induced germination where GerA germination receptor seemed to be dispensable for high-pressure-induced germination. Pressure above 300 MPa are of commercial interest, and are known to trigger germination independent of the germination receptors. When B. licheniformis spores were exposed to very high pressures (550 MPa), the ability of the pressure to induce germination was temperature dependent. That is, only increasing the temperature to 60°C would result in pressure-induced spore germination and inactivation.

På verdensbasis må en stor andel av den industriproduserte maten kastes på grunn av kvalitetsforringelse som følge av mikrobiell aktivitet. Dagens forbrukere ønsker i større grad matvarer som fremstår fersk og har lite tilsetningsstoffer. Dette fører til at såkalte sporedannere utgjør en økende problem for matindustrien. Sporedannere er bakterier, særlig fra slektene Bacillus og Clostridium, som danner endosporer (sporer). Sporene befinner seg i et unikt morfologisk stadium hvor de er ekstremt motstandsdyktige mot miljømessige utfordringer (f. eks næringsmangel, varme, stråling og kjemikalier). De er svært utbredt i naturen og finnes i store mengder i jord, derfor vil de enkelt kunne forurense matvarer og produksjonsutstyr. De aller fleste vegetative bakterieceller vil dø under mildere prosesseringsbetingelser med temperaturer ≤ 100 °C, men sporene vil overleve, vokse og føre til forringelse av matvarene og i verste fall matforgiftning. Bacillus licheniformis er en art som ofte finnes i råvarer og ferdige produkter. På grunn av artens evne til å danne store mengder enzymer, er B. licheniformis ofte knyttet til kvalitetsforringelse av matvarer. Arten har også vært knyttet til tilfeller av matforgiftning etter inntak av blant annet kjøtt og grønnsaksretter, risretter og morsmelkerstatning. Spiring (germinering) av sporene er helt essensielt for at sporene skal kunne forårsake kvalitetsforringelse av matvarer eller matbåren sykdom. I denne prosessen entrer sporene ut av det motstandsdyktige stadiet, og vil igjen bli sårbare for varme og andre påkjenninger. Hovedmålet i dette doktorgradsarbeidet var å beskrive hvordan germinering av B. licheniformis sporer initieres, ettersom det fra før av finnes svært begrenset kunnskap om denne artens germinering. Germinering trigges vanligvis når germineringsreseptorer i sporens indre membran aktiveres av næringsstoffer (oftest aminosyrer), og det igangsettes en prosess som omdanner sporen til en bakteriecelle igjen. Disse germineringsreseptorene finnes i nesten alle sporedannere, og kodes av nært beslektede gener tilhørende gerA familien. I våre studier har vi undersøkt funksjonen til germineringsreseptorene hvis gener finnes i genomet til B. licheniformis stamme ATCC14580/DSM13. Germineringsreseptorene kodes av operonene gerA, gerK og ynd, i tillegg til enkeltgenet yndF2. Aminosyrene L-alanin, L-cystein og L-valin trigger en effektiv germineringsrespons hos B. licheniformis, og våre funn viser at denne responsen er avhengig av at de to germineringsreseptorene GerA og Ynd er intakte i sporene, noe som tyder på at et samarbeid mellom disse to reseptorene. GerA reseptoren var den viktigste germineringsreseptoren for germinering i nærvær av aminosyrer ettersom sporene mistet evnen til å germinere dersom vi slo ut gerA operonet. Ynd reseptoren var ikke essensiell for at sporene skulle germinere, men var viktig for at germineringen skulle være optimal. GerK reseptoren hadde ingen funksjon i germineringsresponsen til aminosyrer, men var derimot viktig for germineringsresponsen i nærvær av glukose. Siden Ynd reseptoren viser en atypisk oppbygning sammenlignet med andre germineringsreseptorer, igangsatte vi videre studier av denne reseptoren. De fleste germineringsreseptorer er bygd opp av tre komponenter, nemlig A, B og C subenhetene. Ynd reseptoren derimot, kodes av ynd operonet som inneholder tre B subenhetgenene i tillegg til A og C subenhetgenene. Når ynd operonet manglet en eller to av de tre B subenhetgenene, opphører funksjonen av Ynd helt. Om alle tre B subenhetene mangler derimot, vil A subenheten fungere i samarbeid med GerA reseptoren. Høytrykk mellom 80 og 600 MPa (790–5900 atm) kan fremkalle sporegerminering i Bacillus arter. Moderat høytrykk (150 MPa) vil i likhet med næringsindusert germinering, aktivere germineringsreseptorene. Ulike germineringsreseptorer utviser ofte forskjellige grader av trykkfølsomhet. I motsetning til hva som ble observert i forsøkene med næringsindusert germinering, viste det seg at Ynd reseptoren var den mest trykkfølsomme reseptoren og bidro mest til høytrykksindusert germinering av sporer. I industriell sammenheng er høytrykk over 500 MPa interessante, og kan indusere en germineringsrespons i sporer som skjer uavhengig av germineringsreseptorene. I våre forsøk kunne B. licheniformis sporer kun germinere under trykk på 550 MPa, om vi økte temperaturen til 60 °C. Disse betingelsene ga også en effektiv inaktivering av sporene.