Microbial denitrification control in acid and neutral soils with implications for greenhouse gas emissions and atmospheric chemistry

Abstract

As with the ancient philosophy of ex nihilo, nihil fit (out of nothing, nothing is produced: nothing comes from nothing), the law of the conservation of mass dictates that no atoms in a chemical reaction may be created or destroyed. Such conservation of Earthly nitrogen makes up the global nitrogen cycle – a series of biological processes continuously recycling nitrogen. Of special interest is denitrification, an anaerobic process which contributes to the sizeable yearly production of environmentally-important nitrite, NO and N2O. In itself, N2O is a powerful greenhouse gas with a global warming potential >300 times that of CO2. Nitrite and NO, in contrast, may influence atmospheric chemical reactions via gaseous nitrous acid (HONO) production, and may also wreak havoc at a molecular level within microorganisms. Nitrite is potentially toxic because of its propensity to form aqueous nitrous acid (HNO2), which is able to pass freely through cell membranes; whereas NO is a key signalling molecule in regulating the transcription of various genes, further demonstrating the biological and chemical impact of denitrification intermediates. Despite its key role in producing environmentally important compounds, there is still considerable ignorance surrounding denitrification in an environmental setting. Not to say our current knowledge is insignificant, quite the contrary: Denitrification is a modular process primarily mediated by bacteria, where nitrate/nitrite is reduced to N2O/N2 via NO; under anoxia denitrifiers shift from respiring O2 to nitrate and other N-oxides; denitrification is adversely affected by O2 levels and decreasing pH (most sensitive being N2O reduction to N2); and many, if not all, of the genes involved in denitrification are controlled by transcriptional regulators influenced by NO. Nevertheless, much of what we currently know has been elucidated from pure culture studies, and precious little is understood in mixed communities or in the environment. Further complicating this, commonly-used investigation methods (e.g. primer based analysis of genes and transcripts) have been restricted by their unsuitability for community-wide application due to inherent biases. Additionally, relatively few studies have attempted to reconcile genetic/transcription studies with phenotypic observations of substrate consumption/production, leading to a disconnect between proposals of molecular systems/responses and real-world effects. Thus, the aim of this thesis was to identify pH-dependent, anaerobic biological and chemical N-redox transformations in soils. The sub-goals therein were to: • Develop improved protocols for co-extracting DNA and mRNA from inhibitor-rich soils for metagenomic/metatranscriptomic analyses • Understand the pH-dependent regulatory mechanisms of denitrification controlling nitrite, NO and N2O accumulation • Map the genetic potential (metagenome) and transcriptional response (metatranscriptome) related to N-transformations by different organism groups, and the realised metabolism (process measurements) • Determine the extent of abiotic reactions controlling nitrite levels in soils of different acidity Soils of contrasting pH (pH 3.8 and 6.8) were assessed for their denitrification ability by monitoring nitrate, nitrite, and N-gas kinetics in microcosm experiments during anoxia (Paper III). Soil pH had the expected effect on N2O reduction: there was immediate reduction at pH 6.8, while pH 3.8 showed negligible reduction during the first 35-40 h. Although both soils produced nitrite and NO transiently, nitrite was kept low at pH 3.8, unlike pH 6.8 where approximately half of added nitrate-N accumulated as nitrite before further reduction. Despite this high total nitrite concentration at pH 6.8, concentrations of un-dissociated HNO2 were two orders of magnitude lower than at pH 3.8. Such information is important for understanding HONO emissions to the atmosphere. To identify the reasons behind these phenotypes, we sequenced the DNA and mRNA of both soils obtained using our Paper I co-extraction method for inhibitor rich samples. Classification revealed contrasting gene and transcript taxonomic profiles, indicating widespread modularity of denitrification potential and activity across microbial guilds in soils. Regardless, both soils had similar denitrification genetic potential, with a clear dominance of nirK and qnor over nirS and cnor. Transcription of nap+nar > nirK+nirS, potentially explaining the accumulation of nitrite at pH 6.8, but not the low nitrite levels at pH 3.8 which were attributed instead to combined chemodenitrification and metabolic control. Curiously, N2O reductase (N2OR) gene transcription at pH 3.8 was detected without corresponding N2O reduction. This is the first time to our knowledge that N2OR gene transcripts from multiple bacterial lineages have been confirmed in the absence of consequent N2O reduction. This suggests that N2OR non functionality is an overarching phenomenon across microorganisms in acid environments, strengthening the hypothesis of post-transcriptional N2OR gene regulation. Abiotic degradation of the same soils was modelled using sterilised soils (Paper II) to clarify the control of nitrite reductases on nitrite levels at different pH. Predictably, chemical decomposition at pH >6 was negligible, but comparable to biological reduction at pH <6. However, under highly acidic conditions (pH <4), abiotic decomposition was overshadowed by enzymatic reduction during most of the incubation period, indicating strong biological suppression of nitrite levels. This non-linear chemical response contends for more careful consideration of abiotic N-kinetics in soils. Collectively, these results present a convincing argument for pH-dependent N2O management in the presence of strong biologically-driven control of potentially toxic and environmentally harmful denitrification intermediates (nitrite and NO). Additionally, this thesis challenges predictions of NO, N2O, and N2 emissions from genetic potential and/or transcriptional activity without relevant phenotypic data.

Parmenides’ utsagn «de nihilo quoniam fieri nil posse videmus» (gresk; fra ingenting kommer ingenting) har sitt motstykke i loven om massens konstans som sier at intet atom i en kjemisk reaksjon dannes eller ødelegges. Det gjelder selvsagt også for nitrogen, som gjennom nitrogensyklusen endrer binding og oksidasjonstrinn gjennom et mangfold av biologiske reaksjoner. Det transporteres mellom biosfære, lithosfære, og atmosfære, men mengden nitrogen forblir konstant. Denitrifikasjon inntar en nøkkelrolle i nitrogensyklusen fordi den resirkulerer nitrogen fra biosfære til atmosfærisk N2. Men i tillegg til N2 produseres også N2O, som er en klimagass med >300 ganger sterkere klimapådriv (pr kg) enn CO2. Videre kan denitrifikasjon gi utslipp av NO og HONO (HNO2), som begge påvirker troposfærens kjemi. NO og HNO2 har også biologiske effekter på andre organismer i jord; de er giftige for noen organismer, og de påvirker genregulering hos andre. Gitt denitrifikasjonens nøkkelrolle i nitrogensyklusen, og dens mangfold av biologiske og økologiske bivirkninger, vet vi mindre enn vi burde om prosessen og organismene. Ikke så å forstå at vi er helt uvitende: vi vet at det er en «modulær» prosess, som reduserer nitrogen trinnvis fra nitrat/nitritt til N2 via NO og N2O, og at de gjør dette for å opprettholde respiratorisk metabolisme i fravær av oksygen. Vi vet at oksygen er en universell repressor av de genene som koder for denitrifkasjons-enzymene, og vi kjenner mange av de andre komponentene i det genregulatoriske nettverket som kontrollerer de enkelte genene. Mye av denne kunnskapen er imidlertid basert på studier av noen få modellorganismer, gjerne studert i renkultur (ikke i samliv med andre organismer), og det råder usikkerhet med hensyn til relevansen av denne kunnskapen for forståelsen av hvordan prosessen reguleres i komplekse mikrobesamfunn. Forsøk på å studere genregulering i slike samfunn har avdekket mange metodiske problemer. Standard-verktøy i slike undersøkelser har vært å kvantifisere gener og gen-ekspresjon basert på Polymerase Chain Reaction (PCR), men svakheten ved denne teknikken er at vi kan få misvisende resultater fordi 1) metodene for ekstraksjon av DNA/RNA er dårligere (bias) og 2) «primerne» fanger kun opp en liten andel av de sekvensene som finnes, for eksempel i jord. En annen svakhet med mange slike molekylærbiologiske studier av denitrifikasjon i jord har vært mangelfull analyse av «fenotypen», det vil si prosesshastigheter og kinetikk. I verste fall har man nøyd seg med å kvantifisere gener og gen-transkripter, og tatt det for gitt at dette er uttrykk for potensiell og faktisk metabolsk aktivitet. Dette er bakteppet for mitt doktorgradsarbeid, som i hovedsak har dreid seg om å bestemme hvordan pH i jord påvirker anaerobe biologiske og kjemiske nitrogen redoks-transformasjoner i jord. Delmålene har vært • Utvikle en bedre metode for effektiv og representativ ekstraksjon av både DNA og RNA fra jord for å muliggjøre troverdige metagenomiske og metatranskriptomiske analyser • Forstå hvordan pH påvirker regulering av denitrifikasjon i jord, og derigjennom regulerer utslippet av NO og N2O • Kartlegge det genetiske potensialet for nitrogentransformasjoner (metagenom), organismenes forsøk på å uttrykke dette potensialet (metatranskriptom), og i hvilke grad de faktisk lykkes (prosess-måling) • Bestemme betydningen av biotisk versus kjemisk transformasjon av nitritt, som funksjon av pH i jord. Jord med pH 6.8 og 3.8 fra et langvarig kalkingsforsøk ble undersøkt med hensyn til denitrifikasjons-kinetikk, deriblant transient akkumulasjon av mellomproduktene nitritt, NO og N2O. Eksperimentene viste den forventede effekten av lav pH på jordens evne til å redusere N2O (forsinket N2O-reduksjon ved lav pH gir høyt utslipp av N2O). Nitritt-akkumulasjon viste det motsatte mønster: jord med pH 6.8 akkumulerte store mengder nitritt, mens nitrittakkumulasjon i sur jord var marginal. På tross av dette var konsentrasjonen av udissosiert nitritt langt høyere i sur enn i basisk jord. Dette belyser pH-virkning på emisjon av HNO, som antas å være proporsjonal med konsentrasjonen av udissosiert nitritt. Metagenomiske ag metatranskriptomiske analyser ble anvendt for å forstå disse fenomenene. Det var klare forskjeller mellom jordtypene, både med hensyn til genetisk sammensetning av denitrifikasjonsfloraen (metagenom) og dens genuttrykk (metatranskriptom), men den totale mengden av gener som koder for de enkelte stegene i denitrifkasjon viste mindre avhengighet av pH, og kunne bare i noen grad forklare de klare forskjellene i prosesshastighet. Dette illustrerer naiviteten i å anta at tilstedeværelsen av et gen (eller et transkript) er ekvivalent med aktivitet. Spesielt viktig er observasjonen av at bakteriene i sur jord åpenbart prøvde å uttrykke genet som koder for N2O-reduktase (de transkriberte nosZ i like stor grad som i basisk jord), men ingen lyktes (ingen aktivitet). Dette er i og for seg observert tidligere, både i renkulturer og i jord, og tilskrives en post-transkripsjonell effekt av lav pH. Mine resultater har imidlertid stor betydning fordi transkripsjon ble undersøkt ved analyse av meta-transkriptomet. Tidligere undersøkelser i jord har alle vært basert på PCR, med de mangler og usikkerheter som er knyttet til dette. På bakgrunn av mine resultater kan vi med langt større sikkerhet fastslå at den post-transkripsjonelle blokkeringen av nosZ-uttrykket ved lav pH er et universelt fenomen. De lave nitritt-konsentrasjonene i sur jord kan i teorien skyldes rask kjemisk nedbrytning av nitritt ved lav pH, det vil si at dette ikke skyldes regulering på cellenivå. For å belyse dette ble den kjemiske nedbrytningskinetikken av nitritt bestemt i gammasterilisert jord, og denne første-ordens kinetikken ble brukt til å modellere nitrittkinetikken i levende jord. Resultatet viste at nitritt holdes lavt i sur jord først og fremst på grunn av bakterienes regulering, og i mindre grad på grunn av kjemisk nedbrytning. De er med andre ord en regulatorisk respons på lav pH. Samlet har resultatene gitt sterk støtte til hypotesen at N2O emisjon kan begrenses ved å juster pH i jord, fordi dette skyldes en post-transkripsjonell effekt av lav pH. Videre er det klart at nitritt-kinetikk i sur jord i all hovedsak er styrt av mikro-organismenes regulering av balansen mellom nitratreduktase og nitrittreduktase.