Vekst og metabolisme av Bacillus spp. i UHT-melk ved ulike lagringstemperaturer, med fokus på proteolytisk aktivitet

Abstract

Melk er veldig næringsrikt og har høy vannaktivitet og tilnærmet nøytral pH. Melk er dermed et utmerket miljø for vekst av mikroorganismer, spesielt bakterier. Kontaminasjon og vekst av sporedannende bakterier, slik som Bacillus spp. kan ha en negativ innvirkning både på produktkvalitet og matvaretrygghet. Arter og stammer av denne slekten kan produsere ekstracellulære, hydrolytiske enzymer som protease, lipase og lecitinase som kan medføre kvalitetsforringelse med bismak og strukturelle defekter. Til tross for moderne produksjonsteknologi og steriliseringsteknikker kan slik kvalitetsforringelse fremdeles gi store økonomiske tap, samt at det kan medføre et dårligere rykte for bedriften.

Denne masteroppgaven var en liten del av et større samarbeidsprosjekt mellom TINE SA og NMBU. Hensikten med oppgaven var å undersøke enzymaktivitet hos ulike Bacillus stammer isolert fra melkeprøver fra TINE SA, og mangfoldet en kan finne blant disse. Innledningsvis ble det gjort et forsøk på et større utvalg av 55 stammer av ulike Bacillus arter, for å undersøke proteolytisk, lipolytisk og fosfolipolytisk aktivitet ved hjelp av diffusjonsanalyse. Diffusjonsanalysen ble utført ved fire ulike temperaturer over tid. Deretter ble det i et hovedforsøk fokusert på proteolytisk aktivitet hos seks utvalgte stammer av Bacillus spp dyrket i UHT-melk ved tre ulike temperaturer; 4, 8 og 22 °C. De ulike stammene var én av hver av Bacillus mycoides, Bacillus licheniformis og fire stammer Bacillus cereus med ulik opprinnelse. Det var av spesiell interesse å undersøke om de ulike artene viste enzymaktivitet ved lave temperaturer som 4 og 8 °C, som da kunne knyttes opp mot noen av utfordringene meieriindustrien opplever i dag.

Samlet ga resultatene i denne masteroppgaven en oversikt over evnen de ulike artene, og også flere stammer innen B. cereus hadde til å uttrykke proteolytisk aktivitet i UHT-melk ved ulike temperaturer. Det var generelt lav vekst, metabolsk aktivitet og proteinnedbryting, med noen unntak, etter inkubering ved 4 °C etter 11 dager. Disse lave effektene ble mer tydelig etter inkubasjon ved 8 og 22 °C. Bacillus mycoides og en stamme av B. cereus var derimot i stand til å vokse og uttrykke enzymaktivitet etter inkubasjon ved 4 °C og i tillegg var én stamme av B. cereus også i stand til å uttrykke noe proteolytisk aktivitet ved samme temperatur til tross for manglende vekst ved 4 °C. I de tilfellene det ble observert proteolytisk aktivitet var det kaseinene som var nedbrutt. Myseproteinene viste små eller ingen tegn til nedbrytning i de fleste tilfeller. Bacillus licheniformis viste seg å være mindre proteolytisk enn de andre stammene i dette forsøket, og denne stammen uttrykte generelt liten aktivitet både når det gjaldt vekst og metabolisme.

I melken inkubert ved 22 °C var det mulig å observere de største endringene både av innhold av frie aminosyrer, flyktige komponenter, organiske syrer og karbohydrater. Funnene understreker viktigheten av å opprettholde en ubrutt kjølekjede, og viser at det bør igangsettes tiltak for å redusere kontamineringsfarer, samt holde et stort fokus på hygiene og lav temperatur gjennom hele verdikjeden.

Milk is very nutritious and has high water activity and approximately neutral pH. Milk is therefore an excellent environment for the growth of microorganisms, especially bacteria. Contamination and growth of spore-forming bacteria, such as Bacillus spp., can adversely affect the quality of the product and the food safety. Species and strains of this genus can produce extracellular, hydrolytic enzymes such as protease, lipase and lecithinase, which can cause quality degradation such as off flavour and structural defects. Despite modern production technology and sterilization techniques, such deterioration of quality can still cause major financial losses, and may lead to a bad reputation for the company.

This master thesis was a small part of a larger collaborative project between TINE SA and NMBU. The main purpose of the study was to investigate the enzyme activity in various Bacillus strains isolated from milk samples from TINE SA, and the diversity one can find among these. Initially, a large sample of 55 strains of different Bacillus species were investigated with the help of diffusion analysis to determine whether or not they could express proteolytic, lipolytic and phospholipolytic activity. The diffusion analysis was performed at four different temperatures over time. Thereafter, the proteolytic activity was in focus, and six strains of Bacillus spp. were chosen to be examined further in a main experiment, where they were to be grown in UHT-milk at three different temperatures; 4, 8 and 22 °C. The different strains were one of each of Bacillus mycoides, Bacillus licheniformis and four strains of Bacillus cereus of different origins. It was of special interest to investigate whether the various species showed enzyme activity at low temperatures like 4 and 8 °C, which could then be linked to some of the challenges the dairy industry is experiencing today.

Overall, the results of this master thesis gave an overview of the ability the various species, and also several strains within B. cereus had to express proteolytic activity in UHT milk at different temperatures. In general, the growth, metabolic activity and protein degradation was low, with some exceptions, after incubation at 4 °C after 11 days. These low effects became more apparent after incubation at 8 and 22 °C. Bacillus mycoides and a strain of B. cereus were on the other hand, able to grow and express enzyme activity after incubation at 4 °C and in addition, one strain of B. cereus was also able to express some proteolytic activity at the same temperatures despite lack of growth at 4 °C. In those cases where proteolytic activity was observed, the caseins were degraded. Whey proteins showed little or no signs of degradation in most cases. Bacillus licheniformis proved to be less proteolytic than the other strains in this experiment, and this strain generally expressed little activity both in terms of growth and metabolism.

In the milk incubated at 22 °C, the biggest changes of both free amino acids, volatile components, organic acids and carbohydrates were observed. The findings in this study emphasize the importance of maintaining a continuous cold chain, demonstrating that measures should be taken to reduce contamination hazards, while maintaining a high focus on hygiene and low temperature throughout the value chain.