Detection and quantification of the food-related bacterial toxins cereulide, lichenysin and botulinum neurotoxin/CD with liquid chromatography – tandem mass spectrometry

Abstract

Food‐ and waterborne illness has a tremendous impact on the society, both economically and through the vast number of diseased people. Increased focus on food safety both at the consumer level and in the food producing industry is necessary to reduce the number of food poisoning outbreaks through extensive knowledge about the possible sources of food poisoning and available detection methods thereof. Bacterial toxins cause foodborne intoxications ranging from widespread disease with relatively mild symptoms to rare but possibly fatal disease. Bacillus species and Clostridium species pose a distinctive challenge due to their endospore forming properties. The endospores are heat resistant and survive the food processing and preparation, enabling germination and toxin production in the prepared food. The main goals of this study have been to develop quantitative detection methods for the bacterial toxins cereulide from Bacillus cereus and lichenysin from Bacillus licheniformis and a qualitative detection method for botulinum neurotoxins from Clostridium spp. A fully validated LC‐MS/MS method has been developed for determination and quantification of cereulide in pasta, rice and cream. This method is now part of the analytical portfolio at Centre for Food Safety, NMBU. Two different studies have been performed to evaluate the cereulide production in food. An inoculation study of emetic B. cereus in rice, pasta and cream revealed cereulide production in the blank samples of rice and pasta. Repetition of the same study with eight different rice and pasta samples without inoculation showed that cereulide was produced in all eight samples. This indicates that the prevalence of emetic B. cereus in rice and pasta is higher than previously assumed. The second study sought to mimic the exposure of cold cuts to room temperature and evaluate the potential of toxin production and bacterial growth during lengthy holiday meals. Psychrotolerant Bacillus weihenstephanensis was used to evaluate the cereulide production. Cereulide concentrations above the infective dose were first obtained after five days storage at 8 C with daily exposure to room temperature varying from 0 ‐2 hours. A fully validated LC‐MS/MS method has been developed for determination and quantification of lichenysin in bacterial cell extracts. Lichenysin from 53 different B. licheniformis strains has been structurally examined with LC‐MS/MS utilising quadrupole – time of flight. All strains produced the same lichenysin isoforms but the ratios between them vary. This finding strengthens the assumption that growth conditions have a greater influence than the genotype on which isoforms are produced. An amino acid substitution in one of the isoforms was detected; also this was present in all samples. An extensive study has been performed on different calibrants for both cereulide and lichenysin, concluding that the use of the analyte itself as calibration standard and isotopically labelled internal standards are of utmost importance to achieve correct quantification. Other calibration standards fail to compensate for matrix effects and other possible influences on the analyte throughout the analysis. A qualitative LC‐MS/MS method for the detection of botulinum neurotoxin /CD in growth medium utilising the toxin’s endopeptidase properties has been developed. Specific product peptides resulting from substrate cleavage by BoNT/CD are detected with LC‐MS/MS instead of the actual toxin; hence, the toxin activity is included in the detection method.

Mat‐ og vannbåren sykdom har en stor betydning for samfunnet, både samfunnsøkonomisk og på grunn av det store antallet mennesker som blir syke. Økt fokus på mattrygghet både på konsumentnivå og i matproduksjonsindustrien er nødvendig for å redusere omfanget av matforgiftning. Omfattende kunnskap om mulige årsaker til matforgiftning og gode deteksjonsmetoder for dem er nødvendige for å oppnå målet. Bakterietoksiner kan forårsake ulike typer matforgiftning, alt fra hyppige utbrudd med milde symptomer til sjeldne, men dødelige sykdommer. Slektene Bacillus og Clostridium er spesielt utfordrende fordi de danner sporer. Sporene er motstandsdyktige mot varme og kan overleve både matproduksjonen og tilberedelsen av mat for deretter å germinere og danne toksiner i den ferdige maten. Hovedmålet med denne oppgaven har vært å etablere kvantitative deteksjonsmetoder for bakterietoksinene cereulide fra Bacillus cereus og lichenysin fra Bacillus licheniformis samt en kvalitativ deteksjonsmetode for botulinum neurotoxin produsert av ulike Clostridium arter. En fullt validert LC‐MS/MS metode har blitt etablert for deteksjon og kvantifisering av cereulide i pasta, ris og fløte. Denne metoden tilbys nå kommersielt fra Senter for Mattrygghet, NMBU. Cereulideproduksjon i mat har blitt evaluert i to ulike studier. En inokuleringsstudie med emetisk B. cereus i pasta, ris og fløte viste at det også ble produsert cereulide i blindprøvene av ris og pasta. Forsøket ble gjentatt uten inokulering med åtte ulike ris‐ og pastaprøver hvor cereulide ble funnet i alle prøvene. Dette antyder at utbredelsen av emetisk B. cereus i ris og pasta er større enn tidligere antatt. Den andre studien etterlignet kaldt kjøttpåleggs eksponering for romtemperatur og evaluerte toksinproduksjonen og bakterieveksten i løpet av langvarige jule‐ og påskefrokoster. Den kuldetolerante bakterien Bacillus weihenstephanensis ble brukt til å evaluere cereulideproduksjonen. Cedeulidekonsentrasjoner høyere enn infektiv dose ble først observert etter fire døgn ved 8 C med daglig eksponering for romtemperatur i 0‐2 timer. En fullt validert LC‐MS/MS metode har blitt etablert for deteksjon og kvantifisering av lichenysin i bakterielle celleekstrakter. Molekylstrukturen til lichenysin fra 53 ulike B. licheniformis stammer har blitt bestemt med LC‐MS. Alle stammene produserte de samme isoformene men med ulikt forhold dem imellom. Dette funnet understøtter antagelsen at vekstforholdene har større innvirkning enn genotypen på hvilke isoformer som dannes. En aminosyresubstitusjon ble oppdaget i én av isoformene, også denne ble påvist i alle prøvene. Ved å studere kvantifisering med ulike kalibreringsstandarder for både cereulide og lichenysin er det vist at bruk av analytten som kalibreringsstandard og isotopmerket intern standard er nødvendig for å oppnå riktig kvantifisering. Bruk av lignende molekyler som kalibreringsstandarder og internstandarder klarer ikke å kompensere for matrikseffekter og annen type påvirkning på analytten i løpet av analysen. En kvalitativ LC‐MS/MS metode som utnytter toksinets endopeptidase egenskaper, har blitt etablert for deteksjon av botulinum nevrotoksin /CD i vekstmedium. BoNT/CD danner spesifikke produktpeptider ved å kløyve et substrat. Deteksjon av produktpeptidene istedenfor BoNT/CD med LC‐MS/MS inkluderer toksinaktiviteten i deteksjonsmetoden.