The microevolution of Renibacterium salmoninarum

Abstract

Renibacterium salmoninarum is the causative agent of bacterial kidney disease (BKD), a chronic infection of cultured and wild salmonids, which can result in acute morbidity or mortality or be a slowly progressive disease causing an often-dramatic decline in growth. BKD is economically important in aquaculture, where it can spread horizontally throughout sea pens or vertically through transferred broodstock or eggs. It is also a concern for conservation and restoration efforts for endangered fish stocks because infections are prevalent among free-ranging Pacific salmon in river and marine systems. New advances in whole-genome sequencing (WGS) were used to provide previously impossible insights into BKD. We assembled the full genomes of 68 unique R. salmoninarum isolates whose origins range widely at spatial, temporal, habitat and host species levels. High-resolution reconstruction of the phylogenomic relationships between strains was possible by using single-nucleotide polymorphisms (SNPs) information. R. salmoninarum was revealed to be a highly clonal bacterium with a relatively slow rate of evolution. Two main lineages were found to exist, provisionally named lineage 1 and lineage 2. Lineage 1 had a cosmopolitan spatio-temporal distribution, while lineage 2 were restricted to rivers of Eastern Scotland and fjords of Western and Northern Norway. Bayesian evolutionary analyses revealed multiple independent introductions of lineage 1 strains across the Atlantic ocean and from one side of the American continent to the other occurring in the last century-and-a-half, consistent with a hypothesis of anthropogenic spread by movement of fish and ova for aquaculture and recreational angling. The comparatively rare lineage 2 appears to have been long-term enzootic to Europe. Strains from different host species were indistinguishable, suggesting free inter-species transmission. Peculiarly, all R. salmoninarum isolates appear to contain the full complement of genes in the species. However, the copy number of dominant virulence factors msa and p22 varied from two to five and one to five, respectively. This copy number variation was common among North American isolates, rare in Norwegian, and completely absent in British. Analyses suggested that the trait had emerged multiple times in independent populations of North America due to local selection pressures. In order to detect copy-number variants and quantify the number of paralogs per strain using WGS data we had to develop a completely new method, described in a standalone, full-length paper and available as open-source software. In summary, the application of WGS and bioinformatic techniques to an important aquaculture pathogen has provided us with unprecedented insights into its genomics, evolutionary processes and transmission dynamics.

Renibacterium salmoninarum er organismen som forårsaker bakteriell nyresjuke (BKD), en kronisk infeksjon hos både oppdrettslaks og vill laksefisk, som kan resultere i akutt morbiditet eller mortalitet eller i andre tilfeller manifestere seg som en sakte progredierende sykdom som gir en dramatisk reduksjon i tilvekst. BKD er økonomisk betydningsfull innen akvakultur, der sykdommen kan spre seg horisontalt mellom merder eller vertikalt gjennom rogn eller flyttede avlsfisk. Sykdommen påvirker også naturvern-, truede dyrearter og artsmangfoldshensyn fordi den er prevalent i villfisk-populasjoner av stillehavslaks i elver og marine systemer. Fremskritt innen helgenomssekvenseringteknikker (WGS) ble brukt til å oppnå kunnskap om BKD som tidligere ville vært umulig. Vi satte sammen genomene til 68 unike R. salmoninarum-isolater hvis opprinnelse varierte svært både geografisk, tidsmessig, artsmessig, samt i habitatet vertsfisken ble isolert fra. Vi kunne rekonstruere detaljert informasjon om fylogenomiske forhold mellom stammene ved å detektere og bruke enkeltbasepolymorfismer (SNPs). R. salmoninarum viste seg å være en svært klonal bakterie med en relativt langsom evolusjonsrate. To hovedgrener ble oppdaget, og de ble foreløpig navngitt gren 1 og gren 2. Gren 1-stammer hadde en variert opprinnelse både med tanke på rom og tid, mens gren 2 kun ble funnet i områdene Skottland, Vest- og Nord-Norge. Bayesianske evolusjonsanalyser pekte på at det i løpet av det siste halvannet århundre har forekommet flere uavhengige introduksjoner av stammer tilhørende gren 1 på tvers av Atlanterhavet, samt fra den ene siden av det amerikanske kontinentet til den andre, noe som samsvarer med en hypotese om menneskelig spredning av sykdommen gjennom forflytning av fisk og rogn i forbindelse med akvakultur og utsett for hobbyfiske. De forholdsvis sjeldne gren 2-stammene virker derimot å ha vært enzootiske innen Europe i lengre tid. Stammer fra forskjellige arter var genetisk uadskillelige, noe som antyder fri smitte mellom artene. Overraskende nok viste samtlige R. salmoninarum-isolater seg å inneholde en komplett samling av genene som er kjent innen arten. Genene varierte dog i antall. Kopitallet til de dominante virulensfaktorene msa og p22 varierte henholdsvis fra to til fem og én til fem. Denne kopinummervariasjonen var vanlig blant Nord-Amerikanske isolater, sjelden blant norske og ikke til stede i britiske. Analyser viste at kopinummer-mutasjonen har forekommet gjentatte ganger i uavhengige populasjoner, og pekte på lokalt seleksjonspress i Nord-Amerika som en sannsynlig årsak. For å detektere kopinummervarianter samt å kvantifisere antall paraloge gen per stamme kun ved hjelp av helgenomssekvenserings-data måtte vi utvikle en helt ny metode, som har blitt beskrevet i en egen artikkel, og som er tilgjengelig i programvare med åpen kildekode. For å oppsummere har helgenomssekvensering og bioinformatiske teknikker blitt anvendt på en patogen som er viktig innen akvakulturen. Dette har gitt oss hittil uovertruffen innsikt i bakteriens genomikk, dens smittedynamikk og de evolusjonære prosessene som former den.