Studies of mechanisms of virulence of viral hemorrhagic septicemia (VHS) : comparison between different genotypes of the virus

Abstract

Viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) has four major genotypes (I, II, III, and IV) with different sub-lineages (Ia-e and IVa-c). VHSV infects a wide-host-range with a preference for low-temperature environments. The virus leads to a deadly disease and causes severe economic losses to rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and olive flounder (Paralichthys olivaceus) farming in Europe and East Asia. Infection also causes great losses in wild fish, particularly in the Great Lakes in North America. The aim of this study (Paper I) was to identify virulence mechanisms of VHSV. It is known that virulence to rainbow trout vary between genotypes and on this basis the pathogenicity profile of different strains was tested for their ability to infect and translocate across polarized, rainbow trout gill epithelial cells (GECs). Infection of GECs in vitro mimic the initial infection process in vivo and four VHSV strains were tested for their ability to infect and translocate across GEC cells. On this basis the strains were separated into two virulence categories, one virulent and one avirulent group. The strains were (or had been tested) tested for in vivo virulence to rainbow trout. Next the different strains were subject to full genome sequencing and the obtained sequences were aligned and from this, single amino acid residues that were different between the two virulence categories were identified and selected as potential virulence residues. Among the differences detected between high and low virulence strains, eight amino acid residues spread across the G, NV, and L proteins were selected. An avirulent, genotype IVa strain (JF-09) was used as a template or backbone, and by use of reverse genetics the selected 8 residues were changed one by one, except for residues in the NV protein that were mutated as a block of 3 residues. The results showed that of those selected, only one residue was found to change the in vitro virulence profile of JF-09. When isoleucine (I) was exchanged with phenylalanine (F) in position 1012 of the L protein the mutated strain changed from an avirulent to an intermediate-virulent variant, using the GECs system in vitro. This residue is located in the conserved region (CR) IV of the L protein (RNA polymerase). In the next study (Paper II), the importance of the terminal untranslated region (UTR) for in vitro viral replication and in vivo pathogenicity was studied. The conserved 3’-terminal sequence was identified as a potential promoter for initiation of RNA synthesis, and a specific sequence in 3’-terminus was then analyzed using an approach by point mutations at nucleotides A4G5 and A7U8. Through various mutations it was shown that the primary sequence (A4G5) at the 3’-terminus is vital for replication and in vitro and in vivo virulence tested in a zebrafish model. Finally, in the third study (Paper III), the importance of the L protein for temperature sensitivity was studied. This study indicated that VHSV strains have different temperature sensitivities. To assess the importance of the L protein as a determinant of temperature sensitivity, the L protein encoding region from two different strains within genotype IV were interchanged. This study showed that the L protein determines temperature sensitivity at elevated temperatures in vitro. From our findings, we conclude that the RNA polymerase (L) is linked with the virulence of VHSV related to infectivity in vitro and in vivo virulence, and also temperature sensitivity. The conserved 3’-terminal promoter sequence is important for optimal replication in host cells and thus virulence, both in vitro and in vivo. Hence, the results obtained add to the understanding of virulence of VHS virus.

Viral hemoragisk septikemi virus (VHSV) har fire genotyper (I, II, III, og IV), med flere subgenotyper (Ia-e og IVa-c). VHSV har et bredt vertsspekter og gir sykdom ved lave vanntemperaturer. Viruset fører til en dødelig sykdom og gir spesielt store økonomiske tap i oppdrett av regnbueørret (Oncorhynchus mykiss) i Europa og i flyndreoppdrett (Paralichthys olivaceus) i Sør-Øst Asia. Med det siktemål å bedre forstå virulensmekanismer hos VHSV for ulike genotyper, ble det i den første studien (Paper I) fokusert på å definere virulensmotivene hos regnbueørretpatogene VHSV stammer. Vi benyttet en in vitro modell som etterligner den naturlige infeksjonsbarrieren hos fisk. Dette ble gjort ved å dyrke gjelle-epitelceller fra regnbueørret (RBT-GEC) som så ble infisert med fire ulike stammer av VHSV, som igjen var inndelt i to forskjellige virulenskategorier (virulente og avirulente stammer). Ved å sammenligne aminosyresekvensen hos de ulike virusisolatene ble 8 utvalgte posisjoner i G, NV, og Lproteinene utvalgt for introduksjon av enkeltmutasjoner (på aminosyrenivå) hos en prototype av et marint VHSV isolat, kalt JF-09, som opprinnelig ikke er virulent overfor regnbueørret og heller ikke infiserer GEC i kultur. Av alle de introduserte mutasjoner så viste det seg at posisjon 1012 i polymerase-proteinet hadde betydning for in vitro virulens i GEC og når isoleucin (I) ble endret til fenylalanin (F), lokalisert i en konservert region (CR) IV i L protein (RNA-polymerase), ble virus ”omdannet” fra en avirulent variant til en middels virulent variant i GECs celler. Dette er første gang det er påvist at virulensegenskaper hos VHSV er knyttet til polymerasen. I den neste studien (Paper II) så vi på betydningen av den 3`-terminalen ikke-translatert regionen (UTR) hos VHSV for in vitro replikasjon og in vivo patogenisitet. Den konservert 3'- terminale sekvensen ble karakterisert og ved hjelp av enkelt posisjon-mutagenese, og posisjonene 4/5 og 7/8 ble studert. Vi foretok en ombytting av nukleotidrekkefølgen i posisjon 4/5, A4G-G5A, og en mutasjon i posisjon 7/8, A7C-U8A. Gjennom in vitro studier fant vi at posisjon 4/5 er en mulig promotor for initiering av RNA-syntese, og at det er en spesifikk sekvens i 3'-enden som er av betydning. På samme måte fant vi at de effekter som ble observert in vitro også lot seg reprodusere in vivo når denne virusmutanten ble benyttet for å infisere zebrafisk. Studien viste at rekkefølgen av den primære sekvensen (A4G5) i 3'-enden er en viktig kode for replikasjon og in vitro/in vivo-virulens. Til slutt, i den tredje studien (Paper III), ble betydningen av L proteinet for temperaturfølsomhet studert. For å vurdere om L proteinet fungere som en determinant for temperaturfølsomhet, ble genet som koder for L-proteinet fra to forskjellige stammer av genotype IV byttet om ved revers genetikk. Disse hydrid-stammene ble så testet ved ulike temperaturer fra 15 °C til 23 °C. Her ble det vist for det første, at ulike VHSV stammer har ulik temperaturfølsomhet og at man ved å bytte om polymerasen kan oppnå både en ”loss-offunction” og ”gain-of-function”. Denne studien viste at L- proteinet spiller en viktig rolle ved temperaturfølsomhet for vekst in vitro. På bakgrunn av disse resultatene konkluderer vi med at RNA polymerase (L) protein er direkte knyttet til de virulensmekanismer hos VHS virus; dette har betydning for smittsomhet mellom fiskearter (host-species specificity) og temperaturfølsomhet. Den konservert 3'- terminale promotorsekvens er viktig for viruset virulens og for optimal replikasjon i vertsceller. Resultatene i denne avhandlingen kan benyttes for å forstå virulensmekanismer og i siste instans også gi verdifulle bidrag til forebyggelse av utbrudd av VHS i oppdrettsnæringen.