Identifisering av kromosomområder som kontrollerer tidspunkt for stengelstrekning i rødkløver med bruk av Genotyping by Sequencing (GBS)

Abstract

En populasjon rødkløver av (Trifolium pratense L., sorten «Lea»), ble karakterisert for tidspunkt for begynnende stengelstrekning (dager til strekning – DTS). Dette er det første synlige steget i overgangen fra vegetativ til blomstrende fase. Av de 672 plantene som ble testet ble 52 av de tidligste (gjennomsnittlig DTS på 37,7) og 52 seneste av de seneste (gjennomsnittlig DTS på 80,5) valgt ut til genetisk karakterisering. Seks uker etter gjennomsnittlig tidspunkt for stengelstrekning i hver av gruppene hadde den tidlige gruppen dobbelt så høy andel skudd i strekning. Genotyping by sequencing (GBS) er et kraftig verktøy for å plukke opp genetisk variasjon. Vanligvis brukes GBS på individnivå men er her blitt brukt på DNA-pooler og antall reads ble brukt til å anslå allelfrekvenser. De 52 individene i hver gruppe ble fordelt på tre tilfeldige undergrupper, og lik mengde DNA fra hvert individ i undergruppen ble kombinert i en «pool» så det ble totalt seks «pooler». SNPer med signifikant forskjellig allelfrekvens i tidlig og sen gruppe ble funnet ved å regne ut parvise Fst-verdier for alle undergrupper mot gjennomsnittlig allelfrekvensen for undergruppene av den andre genotypen (totalt seks fst verdier), og sjekke størrelsen av disse. Sekvensering ble gjort to ganger med ulike restriksjonsenzymer, Pst1 og Apek1. Med Apek1 ble det funnet flest SNPer men kvaliteten av SNPene var bedre blant de funnet med Pst1. Totalt fant jeg 63 SNPer med signifikant forskjellig allelfrekvens mellom den tidlige og sene gruppen (P<0,01 i alle seks fst sammenligninger, false discovery rate <0,001). Signifikante SNPer ble funnet i alle kromosomer med høyest forekomst i kromosom 6 og 7. Bare èn SNP ble funnet med begge enzymer. Noen av SNPene som ble funnet så ut til å ligge i nærheten av QTL for blomstringstid og vinteroverlevelse i som tidligere har vært identifisert i andre populasjoner av rødkløver samt i område som er synteniske til områder i Medicago truncatula med QTL for blomstringstidspunkt. To SNPer som ble funnet kan styrke muligheten for at CONSTANS osom kontrollerer blomstringstid i mange andre planter har homolog som spiller en rolle i tidspunkt for strekning i rødkløver.

A population of red clover (Trifolium pratense L., cultivar «Lea»), was characterized for timing of stem elongation (Days to elongation – DTS). This is the first visible sign of transition from vegetative to flowering phase. Of the 672 plants tested, 52 of the earliest (average DTS of 37,7) and 52 of the latest (average DTS of 80,5) were chosen for genetic characterization. Six weeks after average time of elongation within the two groups the early elongating group had twice the proportion of elongated shoots. Genotyping by sequencing (GBS) is a powerful tool to detect genetic variation. Commonly GBS is performed on individuals but is here performed on DNA-pools and the number of reads is used to estimate allele frequency. The 52 individuals from each group were randomly divided into three subgroups and equal amount of DNA from each individual in each subgroup was combined in a “pool”, creating a total of six “pools”. SNPs with allele frequency that differ significantly between early, and late plants was found by calculating pairwise Fst-values for all subgroups against the average allele frequency of the subgroups of the other phenotypes (a total of six Fst values), and checking the value of these. Sequencing was performed twice, using different restriction enzymes, Pst1 and Apek1. The GBSrun with Apek1 detected most SNPs but the overall quality of the SNPs from Pst1 was better. I found a total of 63 SNPs with significantly different allele frequency between the early and late group (P<0,01 in all six Fst comparisons, false discovery rate <0,001). Significant SNPs was found in all chromosomes with the highest density in chromosome 6 and 7. A single significant SNP was detected with both enzymes. Some of the SNPs appeared to be located near QTLs for time of flowering and winter-survival found in other populations of red clover. Also some SNPs appeared to be located in areas syntenic to QTL for time of flowering in Medicago truncatula. One of the findings suggests that CONSTANS, a gene that controls time of flowering in other plants have a homologue in red clover that plays a role in the timing of flowering.