Local and systemic defence responses in trees against pathogenic fungi : differences revealed at the transcriptional level

Abstract

Forest trees dominate the earth surface and has special place in the economy and ecology of the planet. Due to the long life span of woody trees they are challenged by the abiotic and biotic factors. Over the long history of existence trees have evolved defensive systems that still secure their longevity and dominance. Gymnosperms such as conifers are dominating the temperate forest together with the deciduous angiosperm trees and successfully defended their existence for millions of years. Norway spruce (Picea abies) is an important conifer species, and was selected to explore further its defensive system at the molecular level. Angiosperms are most diverse group of plants at present and contain many important tree species such as aspen (Populus tremula) and other Populus species. Populus having a sequenced genome guided us to aspen as our candidate angiosperm to study its defence responses at the transcriptome level. These most challenging pathogens for these species are the biotrophic and necrotrophic fungi. The resistance level within Norway spruce and Populus species show variation towards both biotrophic and necrotrophic fungi supporting that there is a genetic basis and variation in these genes for resistance. The necrotrophic fungus Heterobasidion parviporum as able to colonize Norway spruce and is responsible for great economic losses. Up to twenty present of the spruce trees in Norway show decay caused by this fungus. In Norway spruce trees with high level of resistance to H. parviporum transcript marker genes such as Chitinase class IV and peroxidases are induced rapidly both locally and systemically at early stages after pathogen infection while in more susceptible plants the response is slower. There are also differences in how these are induced between bark and sapwood. The transcripts level of some genes such a PaChi4 and PaPX3 increased more in the sapwood while the genes like PaPAL2 and PaHCT1 were more upregulated in the bark as a host response to infection. These results suggest that the systemic signalling of defence response may also occur through sapwood. In addition, the local defence responses to necrotroph infection, wounding and methyl jasmonate (MeJ) were found to show similarities. The use of aspen offered a great opportunity to study different aspects including defence responses at the transcriptome level using microarrays. This study addressed the defence responses of a susceptible (23) and relatively resistant (72) SwAsp aspen clone after wounding, and inoculation with a necrotroph (Ceratocystis sp. NFLI 2004-466/501) and a biotroph (Melampsora magnusiana) fungus by looking at the expression of a large part of the expressed genes in this species. Differences between the clones were evident at the transcripts level; the healthy un-inoculated clones showed 552 constitutive genes that were expressed differentially. Differential gene regulation in response to the pathogen attack was also evident between the two aspen clones after biotroph and necrotroph inoculation. In systemic leaves from the susceptible clone no differential regulation of genes found to biotroph while only 7genes in response to the necrotroph at 24 hour post infection. In contrast, 156 genes were differentially expressed in the more resistant clone to biotroph and 283 to necrotroph infection at the same time using microarrays. We also found that a larger portion of differentially regulated genes were upregulated in response to the biotroph while in contrast a majority of genes were downregulated in response to the necrotroph. qRT-PCR validation of selected genes supported that the systemic induction in leaves of clone 72 was higher after biotroph, necrotroph and wounding than in the susceptible clone 23. The regulation of putative defence genes were also followed in the same two aspen clones to find the local and systemic defence response after necrotroph and wounding of the stem. An aggressive and newly discovered necrotroph Ceratocystis sp. from Norway was used to inoculate both clones. In general, clone23 showed as strong defence induction and was higher than in clone 72 at the early stages as a local response to infection. However, clone72 showed systemic response in leaves to the necrotroph and more so to wounding, while clone 23 showed little or no systemic inductions to wounding and necrotroph. The necrotroph was highly aggressive and the results suggest that it has the ability to suppress part of the host defence signalling seen towards wounding. These results also suggest that clone 72 has a fully functional local and systemic defence signalling, while clone 23 is deficient or delayed in its systemic response to wounding and necrotroph. We also followed the defence induction markers, 21 NB-LRR Resistance gene-like homologues and five microRNA (miRNA) putatively targeting NB-LRRs in a relatively resistant Norway spruce clone. Ramets of the clone was wounded and inoculated with the necrotrophic fungus Ceratocystis polonica. The markers showed increase both locally and systemically indicative of a rapid and efficient host response and we also saw local and systemic changes in NB-LRR and miRNA transcript levels. However the transcriptional changes for the NB-LRRs and miRNAs followed were in general small, partly supporting the notion that Resistance-like genes are typically expressed at low and constitutive levels. Comparing the host responses between these two tree species, the results suggest that the defence responses to pathogens and wounding in the gymnosperm Norway spruce and the angiosperm aspen show similarities despite their 300 million years of evolutionary separation. In both species we saw up regulation of defence related genes (such as Class IV chitinases) that are also upregulated in response to necroptrophic pathogens.

Skogstrær er dominerende planter som har stor økonomisk og økologisk betydning. Fordi trær har et langt livsløp utsettes de for betydelige abiotiske og biotiske stressfaktorer. Trær har utviklet effektive systemer for å motstå forskjellige former for stress som gjør at de kan overleve og trives på samme sted over lange tidsrom. Gran (Picea abies) er det viktigste treslaget i Norge og ble valgt ut til videre molekylære studier av dens forsvarssystemer mot skadesopp. Løvtrærne er mer diverse enn bartrærne, men blant løvtrærne finnes mange viktige arter i de nordlige boreale skoger, blant annet osp (Populus tremula) og andre Populus arter. For Populus er genomet sekvensert, noe som ledet oss til å bruke osp i det molekylære arbeidet på transkriptom nivå. De mest utfordrende skadegjørere for trær er biotrofe og nekrotrofe sopper, men det er forskjeller i graden av resistens mot disse skadegjørerne innen treslagene noe som viser at det er en genetisk basis for dette og at det er variasjon i genene for motstandsdyktighet. Granrotkjuka (Heterobasidion parviporum) er en nekrotrof sopp som effektivt angriper gran og gir store økonomiske tap. Over 20 % av grantrærne i Norge er angrepet av rotkjuke ved slutthogst. I grantrær med høy grad av resistens mot granrotkjuke ser man at gener slik som kitinaser (PaChi4) og peroksidaser (PaPX3) induseres raskt både lokalt og systemisk ved et soppangrep, mens mer mottagelige trær viser en forsinket respons. Det er også forskjeller mellom hvordan disse induseres i levende bark og yteved. Genuttrykket av PaChi4 og PaPX3 øker mest i yteved, mens gener som PaPAL2 og PaHCT1 oppreguleres mest i bark etter en infeksjon. Disse resultatene antyder at det også er systemiske forsvarsresponser i ved. I tillegg fant man at den lokale forsvarsresponsen mot det nekrotrofe patogenet viser likhet med responsen til skade og metyljasmonat (MeJ). Bruk av osp har muligjort studier av forsvarsresponser på transkriptom nivå ved bruk av mikromatriser. Studiene av osp ble utført på SwAsp kloner (23 og 72) med forskjeller i resistens mot den biotrofe soppen Melampsora magnusiana, men i tillegg ble responsen mot skade og en nylig oppdaget nekrotrof blåvedsopp Ceratocystis sp. (NFLI 2004-466/0501) studert. Det var store forskjeller molekylært mellom de to ospeklonene. I de friske klonene var 552 gener forskjellige, noe som reflekterer deres forskjellige genetiske bakgrunn. Forskjellen var også stor i hvordan disse reagerte på biotrof og nekrotrof sopp. Den mottagelige klonen (23) viste ingen systemisk induksjon av forsvarsresponser i blader 24 timer etter angrep med biotrof sopp, mens kun syv gener varierte i sitt uttrykk mot den nekrotrofe soppen. I skarp kontrast til dette ble 156 gener regulert i den mer resistente ospeklonen (72) etter behandling med den biotrofe soppen, og hele 283 gener ble regulert etter inokulering med den nekrotrofe soppen. En større andel gener ble oppregulert i den sterke klonen etter angrep av den biotrofe soppen enn mot den nekrotrofe. Senere qRT-PCR validering på utvalgte gener støttet disse resultatene og viste at den systemiske responsen i blader var mye sterkere i den mer resistente klonen (72) enn i den mer mottagelige klonen (23). Reguleringen av antatte forsvarsgener ble så fulgt i de to samme ospeklonene for å finne likheter og forskjeller mellom den lokale og systemiske responsen til den nekrotrofe soppen og til skade i bark på stammen. Den nekrotrofe Ceratocystis sp. ble brukt til å inokulere begge kloner. Klone 23 viste seg å gi lite systemisk rerspons, men like strek eller sterkere lokal respons mot den nekrotrofe soppen som klon 72. Den systemiske responsen mot skade var sterkere i klon 72 enn den var mot den nekrotrofe soppen. Nekrotrofen viste aggressiv vekst i begge klonene, og resultatene antyder at soppen har evnen til å undertrykke forsvarsresponsen i klon 72, mens det systemiske signalsystemet for forsvar mot skade og soppangrep ser ut til å være defekt eller tregt i klon 23. Vi fulgte også transkripsjons nivået av utvalgte markører for indusert forsvar, 21 NB-LRR resistenslignende gener samt fem microRNA (miRNA) i en gran klone med relativt høyt resistens nivå etter inokulering med blåvedsopp (Ceratocystis polonica) og etter skade. Forsvarsmarkørene ble indusert lokalt og systemisk noe som tyder på at klonens forsvarssystemer ble effektivt slått på, vi så også endringer i NB-LRR og miRNA uttrykket lokalt og systemisk. Transkripsjonsforandringene for NB-LRR og miRNA var imidlertid generelt små, noe som delvis støtter det at resistensgener uttrykkes på et lavt og konstitutivt nivå. Når man sammenligner de observerte forsvarsresponser mot nekrotrof sopp og skade mellom gran som er et bartre og osp som er et løvtre ser man likheter, selv om de har vært evolusjonært separert i mer enn 300 millioner år. For eksempel fant vi oppregulering av beslektede gener (som Klasse IV kitinaser) som oppreguleres raskt i respons mot nekrotrof sopp i begge treartene.