Morphological and molecular characterization of developing vertebral fusion in altantic salmon (Salmo salar)

Abstract

Problems with spinal disorders in Atlantic salmon (Salmo salar) have been increasingly in focus due to the importance of this species in the aquaculture industry. Until recently, the molecular development of spinal deformities in fish has received relatively little attention and most studies have been largely descriptive. Due to economical matters of the industry, previous deformity studies were primarily based on radiographic findings, histological staining and field studies to reveal factors inducing deformities. Consequently, few deformities have been explored beyond the level of association with particular causative factors. However, accumulated studies on intensive production regimes and incidence of deformities have been followed by more advanced studies on vertebral development and bone biology. A better understanding of cellular and molecular events during bone development in teleosts should enable us to better characterize the pathology, define particular requirements and enable us to minimize the occurrence of bone disorders. To increase the understanding of normal and pathological bone development in Atlantic salmon, fish was exposed to two different temperature regimes from fertilization until 15g size. Fish exposed to high temperature regimes showed a markedly higher growth rate and a significant higher percentage of vertebral fusions than fish reared at low temperatures. The major aim of paper I, II and III was to study the long term effect of hyperthermic conditions upon bone development in Atlantic salmon with focus on pathological development of spinal fusions. Analyzing non-deformed vertebrae from the two temperature regimes (paper I) revealed that the increased risk of developing vertebral fusions was linked to a down-regulated transcription of genes involved in production and mineralization of extracellular matrix components. Furthermore, morphological changes in the arch centra identified chondrocytes with a distorted maturation pattern and an increased zone of hypertrophic chondrocytes. The data presented indicate that production of both bone and cartilage is disrupted when fast growth is promoted. Paper II and III were devoted to characterize developing spinal fusions, hence describe typical hallmarks in the fusion process. An intermediate and a terminal stage of the fusion process were studied at a morphological level using radiography and histology and at a gene expressional level using quantitative real-time PCR, in situ hybridization and immunohistochemistry. In paper II the focus was directed towards bone and cartilage formation in the centra, whereas in paper III the notochord was analyzed. The development of vertebral fusions is a dynamic process, but as suggested in this thesis, the process may be summarized as four major events. First, disorganized and proliferating cells were prominent at the vertebral growth zones and in the notochord. The marked border between the osteoblast growth zones and the chondrocytic arches became less distinct, as proliferating cells and chondrocytes blended through an intermediate zone (paper II). Second, in situ hybridization visualized that proliferating cells in the intermediate zone co-expressed mixed signals of chondrogenic and osteogenic markers, suggesting a metaplastic shift in these cells (paper II). A similar shift also occurred in the notochord where proliferating chordoblasts changed transcription profile to be more osteogenic (paper II and III). Third, as the pathology progressed, the notochordal sheath stretched and a thinner and more fragmented elastic membrane was detected (paper III). Immunohistochemistry further revealed that the structural organization in the notochordal sheath was altered upon development of vertebral fusions. Fourth, ectopic bone formation was found in the arch centra and in the intervertebral regions (paper II). The formation of ectopic bone indicated that the metaplastic shift in proliferating cells led to cells capable of producing mineralized matrix. The major aim of paper IV was to develop an in vitro system for Atlantic salmon osteoblasts so that problems related to bone development could be more specifically targeted. Unspecialized primary cells from Atlantic salmon white muscle differentiate in osteogenic medium to osteoblasts-like cells. The cells changed their morphology from elongated to become more cobblestone, started expressing osteoblast specific markers and stained for Alkaline phosphatase during the differentiation period. The differentiated cells were further used to study the effects of two factors that influence bone formation in Atlantic salmon under commercial farming conditions; elevated temperature and polyunsaturated fatty acid composition. The in vitro response showed resemblances with in vivo findings, supporting that we had succeeded in differentiating the precursor cells to become osteoblast like cells. Through the work presented in this thesis we have added knowledge to both normal and pathological development of the Atlantic salmon vertebrae. Most markers for bone and cartilage development had not previously been described in Atlantic salmon. The defined markers can be used to investigate how the progression of skeletogenesis is modulated by a variety of factors and reveals the potential use of gene transcription profiling as a prognostic approach in aquaculture. Moreover, Atlantic salmon has shown to be comparable to mammalian models used in revealing the complex pathology involved in the development of spinal malformation.

Problemer med deformerte ryggvirvler hos Atlantisk laks (Salmo salar) har vært stadig mer i fokus på grunn av dens betydning i oppdrettsnæringen. Inntil nylig har den molekylære utvikling av ryggdeformiteter i fisk fått relativt lite oppmerksomhet og de fleste studier har i stor grad vært deskriptive. Basert på økonomiske hensyn har tidligere studier primært vært basert på å avdekke spesifikke utløsende faktorer som induserer deformiteter. Til dette har man benyttet forskingsverktøy som røntgen, histologi og feltstudier. Studier av intensive produksjonsregimer og forekomst av misdannelser har etter hvert blitt fulgt av mer avanserte studier av ryggvirvelutvikling og benbiologi. En bedre forståelse av cellulære og molekylære mekanismer i benutviklingen hos teleoster vil gi oss et bedre grunnlag til å forstå patologien, bidra til å definere spesielle behov og dermed minske forekomsten av skjelettdeformiteter. Målet med artikkel I, II og III var å studere den langsiktige effekten av hyperthermi på benutvikling hos Atlantisk laks med fokus på patologisk utvikling av fusjoner. Det ble gjennomført et eksperimentelt forsøk hvor fisk ble eksponert for to ulike temperaturregimer fra befruktning frem til 15g størrelse. Fisk utsatt for høy temperatur viste en langt høyere vekstrate og en betydelig høyere andel av vertebrale fusjoner enn fisk som hadde blitt utsatt for lave temperaturer. Ved å analysere ikke-deformerte virvler fra de to temperaturregimene viste det seg at den økte risikoen for å utvikle fusjoner var knyttet til en nedregulert transkripsjon av gener involvert i produksjon og mineralisering av ekstracellulær matriks (artikkel I). Det ble også funnet at rask vekst forstyrrer produksjon av både ben- og bruskdannelse. Morfologiske analyser av bruskområdene viste at chondrocytene hadde et forandret modningsmønster og en økt sone av hypertrofe chondrocyter. Dataene som presenteres viser at rask vekst forstyrrer produksjon av både ben- og bruskdannelse. I artikkel II og III ble typiske utviklingstrekk i fusjonsprosessen beskrevet. Et intermediært og et terminalt stadium av fusjonsprosessen ble studert morfologisk ved hjelp av røntgenundersøkelser og histologi og på et molekylært nivå ved hjelp av kvantitativ real-time PCR, in situ hybridisering og immunohistokjemi. I artikkel II var fokuset rettet mot ben- og bruskdannelse i virvlene, mens i artikkel III ble notokorden analysert. Utviklingen av vertebrale fusjoner er en dynamisk prosess, men som foreslått i denne avhandlingen kan prosessen oppsummeres i fire store hovedmomenter. For det første observerte vi uorganiserte og prolifererende celler i vekstsonene på toppen av virvlene. Grensen mellom osteoblast- og chondrocytområdene ble mindre tydelig ettersom de prolifererende cellene blandet seg og dannet en overgangssone (artikkel II). For det andre viste in situ hybridisering at disse prolifererende cellene uttrykte både chondrogene og osteogene genmarkører, noe som tyder på et metaplastisk skifte i disse cellene (artikkel II). Et tilsvarende skifte oppstod også i notokorden der prolifererende chordoblaster forandret transkripsjonsprofil til en mer osteogen fenotype (artikkel II og III). For det tredje ble notokordskjeden strukket og den elastiske membranen som omgir notokorden ble tynnere og mer fragmentert ettersom patologien utviklet seg (artikkel III). Immunohistokjemi avdekket videre at den strukturelle oppbyggingen av notokordskjeden ble forandret under utviklingen av fusjoner. For det fjerde ble ektopisk bendannelse oppdaget i bruskområder og i intervertebrale områder (artikkel II). Dannelsen av ektopisk ben indikerte at det metaplastiske skiftet i prolifererende celler førte til celler som var i stand til å mineralisere matriks. Det primære målet i artikkel IV var å utvikle et in vitro system for osteoblaster fra Atlantisk laks slik at man lettere kan studere spesifikke problemer tilknyttet benutvikling. Uspesialiserte primærceller fra laksens hvite anaerobe muskler ble dyrket i osteogent medium til osteoblastlignende celler. I løpet av differensieringsperioden forandret cellene morfologi fra en avlang form til å bli mer firkantet, de uttrykte osteoblast-spesifikke markører og farget for alkalisk fosfatase. Videre ble de differensierte cellene brukt til å studere effekten av to faktorer som påvirker bendannelse hos oppdrettslaks; høy temperatur og sammensetningen av flerumettede fettsyrer. In vitro responsen viste likheter med in vivo funn og støtter opp om at vi har lykkes i å differensiere forløperceller til osteoblastlignende celler. Gjennom det arbeidet som presenteres i denne avhandlingen har vi fått en bedre kunnskap om den normale og den patologiske utvikling av ryggvirvlene hos Atlantisk laks. De fleste markører for ben- og bruskutvikling har ikke vært beskrevet tidligere i laksefisk. De definerte markørene kan brukes til å undersøke hvordan utviklingen av ryggraden påvirkes av en rekke faktorer og viser potensialet for bruk av gentranskripsjon som en prognostisk tilnærming i akvakultur. Videre har Atlantisk laks vist seg å være sammenlignbar med pattedyrmodeller som brukes til å undersøke den komplekse patologien involvert i utviklingen av ryggmisdannelser.