Studies on proteins from Methylococcus capsulatus Bath : expression in Lactobacillus plantarum WCFS1, purification and large-scale fermentation

Abstract

The work described in this thesis is part of a larger project investigating the non-commensal methanotroph Methylococcus capsulatus Bath. This species has shown anti-inflammatory and obesity-reducing effects in animal models when given as an extract in the diet. In silico studies of the M. capsulatus Bath genome revealed four genes (mam, tir, mif and sim) that encode proteins which are homologous to proteins with known immunomodulatory functions. They might therefore contribute to the observed effects. These proteins (Mam, Tir, Mif and Sim) were the focus of this thesis. The genetic sequences from M. capsulatus Bath were cloned into the pSIP401 vector of the pSIP inducible gene expression system. They were successfully transformed into the lactic acid bacteria Lactobacillus plantarum WCFS1. Inducible protein expression was successfully accomplished as verified with Western blot. The genetic sequences were also cloned into the pNIC-CH vector for purification of protein. The proteins were successfully produced in Escherichia coli BL21 and purified with immobilized metal ion affinity chromatography. . After successfully producing purified protein and lysate from L. plantarum harbouring the pSIP401-derivatives, in vitro assays were performed. In the first assay, effects of these bacterial stimuli on interleukin (IL)-1b-induced production of IL-8 was investigated. In the second assay, effects on transepithelial electrical resistance when co-incubated with tumour necrosis factor (TNF)a. Neither of these assays were successful, however. Finally, L. plantarum harbouring pSIP401_MAM or empty vector were cultured in 12-liter batch fermentations by using a 15-liter bioreactor. The resulting broth was lysed via French pressing and lyophilized before being shipped away to Copenhagen, to be used in a murine study.

Arbeidet som ble gjennomført i denne masteroppgave er en del av et større prosjekt som undersøker den metanotrofe bakterien Methylococcus capsulatus Bath. Denne bakterien, som ikke finnes i tarmfloraen, har fått påvist betennelsesdempende og fedmereduserende effekter i dyreforsøk når den blir gitt som et ekstrakt i fôret. In silico-studier av genomet til M. capsulatus Bath viste at fire gener (mam, tir, mif og sim) koder for proteiner som har homologi til proteiner med kjente immunomodulerende effecter. Disse proteinene (Mam, Tir, Mif og Sim) var fokuset I denne oppgaven. Gensekvensene fra M. capsulatus Bath ble klonet inn i pSIP401-vektoren som er en del av det induserbare genuttrykkssystemet pSIP. De ble deretter transformert inn i melkesyrebakterien Lactobacillus plantarum WCFS1. Induserbar produksjon av protein ble deretter verifisert ved bruk av Western blot. Gensekvensene ble også klonet inn i pNIC-CH-vektoren for rensing av protein. Proteinene ble produsert i Escherichia coli BL21 og renset ved bruk av kolonnekromatografi. Etter at renset protein og lysat fra L. plantarum med pSIP401-derivatene var gjennomført ble to in vitro-forsøk utført. I det første forsøket ble effekter av de bakterielle stimuliene på interleukin (IL)-1b-indusert produksjon av IL-8 undersøkt. I det andre forsøket ble effekter av stimuliene sammen med tumour necrosis factor (TNF)-a på elektrisk motstand over et epitelcellelag undersøkt. Ingen av disse to assayene var vellykket. Til slutt ble L. plantarum med pSIP401_MAM eller tom vektor dyrket i 12-liters batchfermenteringer i en 15-liters bioreaktor. Bakteriemassen ble deretter lysert med French press, før den ble frysetørket og sendt til København for å brukes i et museforsøk.