Betalainer i beter (Beta vulgaris) : utvikling av analysemetodikk og kartlegging av betalainer i betesorter

Abstract

Det har blitt utviklet en metode for ekstraksjon og kvalitativ og kvantitativ analyse av betalainer med HPLC-MS og spektrofotometer. Betalainene ble ekstrahert fra både rødbete, gulbete og polkabete (Beta vulgaris).

HPLC-parameterne ble valgt slik at separasjonen gikk så raskt som mulig for å hindre potensiell degradering av betalainer og samtidig få baselinjeseparasjon av forbindelser. Separasjon ble oppnådd med en Kinetex XB C18 reversfasekolonne fra Phenomenex, 2,1 x 150 mm, partikkelstørrelse 2,6 m og porestørrelse 100 Å, og mobilfase bestående av vann og acetonitril med 0,1% maursyre.

Den kvalitative delen av analysen ble utført med en HPLC-ESI-Q-TOF i positiv skannmodus med skannhastighet 1 spekter/sekund i området m/z 100-1700. Trykket i forstøveren var 25 psig og for tørkegassen ble temperaturen satt til 325C med en flow på 11 L/min. Kapillærspenningen var på 3500 V og fragmentorspenningen på 150 V. Det ble opprettet en database med massene til kjente forbindelser i beter og denne ble brukt til å identifisere betalainene. Det ble identifisert ti kjente betalainforbindelser i den kvalitative analysen.

Para-aminohippursyre som internstandard bidro til å kunne trekke konklusjoner om andre forbindelsers retensjonstider ved forskjellige analyser, i tilfelle retensjonsmønsteret driftet. Dette forenklet identifiseringen av topper fra gang til gang. Den var også anvendelig for å følge ekstraksjonstrinn for fargestoffet i beter for å kunne skille ekte ekstraksjon fra vask.

Prøveopparbeidelse og ekstraksjon viste god presisjon og reproduserbarhet ved gjentatte analyser, både fra dag til dag og innen samme dag. Studien viste videre at betalainer ekstraheres mer effektivt ved 5:1 løsemiddel/bete-ratio enn 3:1, og med 25% metanol i vann (v/v) enn med høyere andel metanol. Ekstraksjonene tyder på at alt betalaininnhold blir løst ved første gangs tilsetning av løsemiddel, fordi internstandarden som ikke binder til noe følger samme prosentvise fordeling. En kraftigere sentrifugering og bedre dekantering/fjerning av supernatant kreves for å nærme seg 100% utbytte ved første ekstraksjonsrunde. For at at dette skal være gunstig må ekstraktene være stabile slik at aktivitetstap ikke finner sted. Filtrering av ekstraktet er også en mulighet.

Det ble utført tre forskjellige stabilitetsforsøk: - Lagring av oppkuttede beter ved frysing (-20C og -80C) og frysetørking viste ingen tegn til forskjell i fargedegradering av betacyanin ved noen av betingelsene i forsøket. - Stabilitetsforsøk med forskjellig pH i ekstraktene viste ingen signifikant forskjell i pH- området 4,7 til 6,6. Dette viste at analysen ikke er sårbar for pH-endringer i dette området. - Ved lagring av ferdig ekstraherte prøver holder ekstraktene seg stabile i minst 18 timer ved 5C i lukket beholder skjermet for lys. Imidlertid var det indikasjoner på en svak økning av rødfarge som muligens skyldtes nedbrytning av et gult fargestoff og ga et rødt innslag. Forsøk på ikke-sentrifugerte ekstrakter eksponert for lys og luft viste endringer som kunne forklare dette, men med mye kraftigere effekt.

En viktig del av denne oppgaven var å bestemme reproduserbarheten til analysen av betalainer på spektrofotometer benyttet for kvantifisering. Den mest tilgjengelige måten å sikre analysens reproduserbarhet var å benytte en kommersiell betaninstandard. En standardkurve for stoffet som dekket det dynamiske måleområdet for spektrofotometeret (Abs 0,2 – 0,7) ble opprettet for dette formålet. Standardkurven viste god reproduserbarhet og presisjon.

Fire betesorter (‘Touchstone Gold’, ‘Guardsmark’, ‘Bettollo’ og ‘Taunus’) ble analysert for mengde betalainer. Innholdet av betalainer ble målt innen sorter og mellom sorter. Resultatene viste at alle sorter hadde store forskjeller mellom individer. Gulbeten (‘Touchstone Gold’) hadde minst variasjon i betacyanininnhold mellom ulike individer, hvor forskjell mellom laveste og høyeste verdi var 12%. Polkabeten (‘Guardsmark’) viste størst individvariasjon i betacyanininnhold og hadde minst av både betacyanin og betaxanthin, henholdsvis 0,029 mg/g våtvekt og 0,019 mg/g våtvekt.

Det var også store forskjeller mellom sortene, med desidert mest fargestoff i rødbetene, både av betacyaniner og betaxanthiner. Industrirødbeten (‘Taunus’) hadde mest innhold av både betacyanin og betaxanthin med henholdsvis 0,87 mg/g våtvekt og 0,29 mg/g våtvekt. Resultatene overensstemmer med tidligere dokumenterte verdier.

A method for extraction and qualitative and quantitative analysis of betalains with HPLC-MS and spectrophotometer has been established. Betalains was extracted from both red, yellow and Chioggia beets (Beta vulgaris). To avoid degradation of the betalains a fast separation technique on HPLC was desired, while at the same time maintaining baseline separation of the compounds. Separation was achieved with a Kinetex XB C18 reverse phase column from Phenomenex, 2.1 x 150 mm, particle size 2.6 μm and pore size 100 Å, and a mobile phase consisting of 0.1% formic acid in water and acetonitrile. The qualitative part of the analysis was conducted with HPLC-ESI-Q-TOF in positive ionization scan mode and a scan rate of 1 spectrum/second in the area m/z 100-1700. Nebulizing pressure was 25 psig and drying gas was set to a temperature of 325°C and a gas flow of 11 L/min. Capillary voltage was 3500 V and fragmentor voltage 150 V. A database with masses of known beet compounds was created and used for identification of betalains. Ten betalain compounds was identified during analysis. Sample preparation and extraction displayed satisfactory precision and reproducibility, both from day to day and within the same day. The study showed that betalains are more efficiently extracted with a solvent/beetroot ratio of 5:1 rather than 3:1, and solvent with 25% methanol in water (v/v) rather than with higher amounts of methanol. The distribution of internal standard in sample extracts indicates that the betalain content is extracted in the first extraction step. A more powerful centrifugation and a more complete decantation of supernatant is required for a better betalain yield in the first step. Filtration of the extract is also a possibility. Three experiments on stability were conducted: - Storage of diced beets by freezing (-80°C and -20°C) and freeze drying showed no difference in colour degradation of betacyanin. - There was no difference in beet extract stability between pH 4.7 and 6.6. - Beet extracts are stable for at least 18 hours at 5°C if sealed and stored in a dark environment. It was noted a small increase in betacyanin content during this interval that might result from degradation of betaxanthin where the colour changes from yellow to orange. An experiment on non-centrifuged extracts was conducted and showed a visually similar trend. An assessment of the reproducibility of the spectrophotometer analysis was required preceding the quantitation of betalains. For this purpose, a commercial betanin standard was applied, and a standard curve that covered the dynamic range of the spectrophotometer (Abs 0.2 – 0.7) was generated. The precision of the standard curve was concluded to be sufficient. The betalain content of four different beet cultivars (‘Touchstone Gold’, ‘Guardsmark’, ‘Bettollo’ and ‘Taunus’) was analysed. Individuals within the same cultivar were compared and relatively large discrepancies were found. The yellow beet, ‘Touchstone Gold’, showed the least variation in betacyanin content with a 12% level difference. The Chioggia beet, ‘Guardsmark’, showed the highest variation with a 116% level difference and was also the cultivar with the lowest content of betalains altogether (0.029 mg betacyanin/g fresh weight and 0.019 mg betaxanthin/g fresh weight). The four cultivars differed in the amount of betalains present, with red beets having the highest levels of both betacyanin and betaxanthin. The beet cultivar with the highest content altogether was ‘Taunus’, with a betacyanin content of 0.87 mg/g fresh weight and betaxanthin content of 0.29 mg/g fresh weight. These results are in accordance with earlier research.