| dc.description.abstract | The long term goal of this study was to develop towards a non-genetically modified organism (non-GMO) as human mucosal vaccine against tuberculosis (TB), using lactic acid bacteria (LAB) as a delivery vehicle for surface anchored antigen-containing proteins. LABs have characteristics that make them excellent as delivery vehicle for vaccines: they are not associated with pathogenesis, they have been used in the food industry for centuries, they have known probiotic effects, and they are natural inhabitants of the human gastrointestinal tract (GIT) where they interact with immune cells in the mucosal surfaces. Additionally, LABs have the ability to survive the tough environmental conditions following an oral administrated vaccine, e.g. as the low pH values ranging from 1.8–3.
In this study, the widely studied antigens Ag85B and ESAT6 from the TB causative agent Mycobacterium tuberculosis (Mtb) were fused together to a 41 kDa protein, and various anchors were attached. The proteins were expressed in, and extracted from E. coli strains before being anchored to Lactobacillus spp and B. subtilis. The anchors used were peptidoglycan binding domains with a Lysine Motif (LysM domain). The two anchoring domains were tested; a single LysM domain from the L. plantarum protein Lp_3014 (extracellular transglycosylase), and the double LysM domains from the L. plantarum protein Lp_2162 (muropeptidase). To test the stability of the resulting constructs, L. plantarum loaded with recombinantly produced LysM containing Ag85-ESAT6-DC were subjected to 2% bile and pH values ranging from 1.8–6.5, showing that the antigen-containing proteins were able to resist degradation when incubated at low pH. This indicated that the protein-loaded bacteria would be capable to survive incubation at low pH values. However, the co-incubation of bile and the negative control (L. plantarum not displaying Ag85-ESAT6-containing protein) were revealing positive signals, thus implying that the positive signals achieved from co-incubating the protein-loaded bacteria and 2% bile could contain false positives, when analyzed by western blotting and flow cytometry. Incubation in bile should, therefore, be repeated using another method.
Previous studies have shown that LAB displaying the Ag85-ESAT6-DC on their surfaces creates promising immune responses. The current results, thus provide a promising starting point towards achieving the final goal; developing a non-GMO vaccine against TB, that elicits better and longer lasting immune responses than the now available BCG-vaccine.
Det langsiktige målet for denne studien var å utvikle en ikke-genetisk modifisert organisme (ikke-GMO) til å bruke som en menneskelig vaksine mot tuberkulose, ved hjelp av melkesyrebakterier som overleveringsagenter for overflatefestede proteiner som inneholder antigenene. Melkesyrebakterier har egenskaper som gjør dem svært godt egnet som overleveringsagenter for vaksiner; de er ikke assosiert med patogenesitet, de har vært brukt i matindustrien i århundrer, de har kjente probiotiske effekter i tillegg til deres naturlige tilstedeværelse i det humane mage-tarm systemet, der de interagerer med immuncellene i slimhinnene. Melkesyrebakterier har i tillegg evnen til å overleve det utfordrende miljøet som følger en oralt administrert vaksine, f.eks. lave pH-verdier, i området 3–1.8.
I denne studien ble de bredt-diskuterte antigenene Ag85B og ESAT6 fra tuberkulosens utløsende agent, Mycobacterium tuberculosis (Mtb), sammensatt til et protein på 41 kDa tilsatt forskjellige ankere. Proteinene ble uttrykt i og ekstrahert fra E. coli-stammer før de ble ankret til Lactobacillus spp og B. subtilis. Ankerene som ble brukt var peptidoglucan bindende domener med et Lysine Motif (LysM domene). De to ankringsdomenene som ble testet; et enkelt LysM domene fra L. plantarums protein Lp_3014 (extracellulær transglykosylase), og det doble LysM domenene fra L. plantarums Lp_2162 (muropeptidase). For å teste stabiliteten til det resulterende konstruktet, ble L. plantarum ladet med det rekombinante produserte LysM inneholdende Ag85B-ESAT6-DC følgende inkubert i 2 % galle og pH-verdier som strekker seg fra 1.8–6.5. Dette viste at det antigen-inneholdende proteinet var i stand til å motstå degradering når den ble inkubert i lave pH-verdier. I motsetning viste den negative kontrollen (L. plantarum, ikke ladet med det antigeninneholdende proteinet), når inkubert i galle, positive signaler. Dette gav en indikasjon på at det oppnådde positive resultatet av den inkuberte proteinladede bakteriecellen i galle, muligens inneholdt falske positiver etter å ha blitt analysert med western blotting og væskestrømscytometri. Inkubering i galle burde derfor gjentas ved å bruke en annen metode.
Tidligere studier har vist at melkesyrebakterier ladet med antigenet A685B-ESAT6-DC på celleoverflaten oppnådde lovende immunresponser. De nåværende resultatene gir et lovende startpunkt mot å oppnå det optimale målet: å utvikle en ikke-GMO vaksine mot tuberkulose, som fremprovoserer bedre og lengre immunresponser enn den nå tilgjengelige BCG-vaksinen. | nb_NO |
