Sorting Nexin 4 medierer korrekt kromosomoppstilling på ekvatorialplanet

Abstract

A screen performed by members of the Stenmark laboratory where siRNA-mediated knock down of 70 proteins with a potential role in cytokinesis was performed, revealed a potential role for Sorting Nexin 4 (SNX4) in mitosis. Cells that lacked SNX4 seemed to stop up in prometaphase (unpublished findings from the Stenmark laboratory). Based on these initial findings we therefore decided to investigate whether SNX4 is a true mediator of mitosis. HeLa cells were transfected with siRNA targeting SNX4 to investigate the effects of SNX4 deficiency in the cells. To determine where SNX4 localized in cells and if its localization changed during mitosis, HeLa cells were transfected with and control SNX4 siRNA, fixed on cover slips, and stained with antibodies before SNX4 microscopy. Lastly, we performed live-cell imaging of SNX4 depleted cells through mitosis in order to more thoroughly study the effects of SNX4 knockdown. We found that SNX4 knock down cells had increased percentage of cells in early mitosis and a decreased percentage of cells in cytokinesis compared with control cells. Confocal microscopy of HeLa cells stained with antibody against SNX4 showed that this protein was localized to the spindle poles in metaphase. The live-cell imaging showed that SNX4 depleted cells spent more time in prometaphase and metaphase and had a higher percentage of cells that struggled to align their chromosomes properly and to complete mitosis. Altogether our findings support our hypothesis that SNX4 is a true mediator of mitosis. Since a greater proportion of the SNX4-depleted cells were struggling to progress to anaphase and had alignment problems in metaphase compared with control cells, we suggest that SNX4 plays a role in chromosome congression. Knock down of various proteins involved in congression results in the same phenotypes as with SNX4 knock down, further strengthening our hypothesis. We therefore suggest two possible molecular mechanisms for SNX4 function in congression. The first considers that SNX4 contributes to the stability of the mitotic spindle by loading spindle stabilizing proteins on to the spindle in early mitosis. The second theory is that SNX4 contributes to motor protein activity in congression.

Et screen satt opp i Stenmarklaboratoriet der det ble benyttet siRNA mot 70 proteiner som var potensielle medhjelpere i celledeling plukket opp proteinet Sorting Nexin 4 (SNX4) som en interessant kandidat å studere videre (upubliserte funn fra Stenmarklaboratoriet). Det ble funnet at celler som manglet SNX4 viste tegn til opphopning i prometafase, og det ble derfor bestemt å undersøke om SNX4 er en sann mediator av mitosen. I denne oppgaven ble HeLa-celler transfektert med siRNA mot SNX4 for å undersøke effektene av SNX4-mangel i cellene. HeLa-kontrollceller og SNX4-knockdownceller ble fiksert på dekkglass og farget med SNX4-antistoffer før mikroskopering for å undersøke hvor SNX4 lokaliserer i cellen og om lokaliseringen av SNX4 var spesifikk i mitosen. Det ble også benyttet mikroskopering av levende celler for å kunne følge SNX4-depleterte celler gjennom mitosen for å grundigere kunne studere effektene av SNX4-knockdown. Det ble funnet at SNX4-knockdownceller hadde en økning i andelen celler i tidlig mitose og en nedgang i andelen celler i cytokinese sammenliknet med kontrollceller. Ved konfokalmikroskopi av HeLa celler farget med SNX4-antistoff ble SNX4 funnet å lokalisere til spindelpolene i metafase. Cellefilmene fra mikroskopering av levende celler viste at SNX4-depleterte celler brukte lengre tid på å komme til anafase og hadde større andel celler som slet med å gjennomføre mitosen korrekt. Funnene våre underbygde teorien vår om at SNX4 er en sann mediator av mitosen. Siden en økt andel av de SNX4-depleterte cellene slet med å komme seg til anafase og hadde problemer med å danne et organisert metafaseplan sammenliknet med kontrollcellene var det nærliggende å foreslå at SNX4 spiller en rolle i kromosomcongression. Det ble utarbeidet to ulike teorier om hvordan SNX4 påvirker kromosombevegelse. Den ene går ut på at SNX4 bidrar til å øke stabiliteten av den mitotiske spindelen ved å bringe spindelstabiliserende proteiner til spindelen i tidlig mitose. Den andre teorien er at SNX4 bidrar til motorproteinaktivitet i congression. Motorproteiner omgjør kjemisk energi til bevegelsesenergi og er essensielle for kromosomtransport i congression. Knockdown av ulike proteiner som bidrar i disse operasjonene som det tenkes at SNX4 kan være med å styre gir de samme fenotypene som SNX4-knockdown. Dette styrker våre teorier ytterligere. Mye tyder på at SNX4 er en sann mediator av congression.