Effekt av Leuconostoc gasicomitatum på mikroflora i kittmodnet ost, og karakterisering av bakteriocinet leucocin H

Abstract

Leuconostoc gasicomitatum er én av flere bakteriocinproduserende melkesyrebakterier. Hos denne arten har man oppdaget produksjon av det sirkulære bakteriocinet leucocin H. Dette bakteriocinet har tidligere vist aktivitet mot flere blant annet Listeria monocytogenes, Clostridium perfringens og Bacillus cereus. Genomsekvensering av Leuconostoc gasicomitatum LMGT 3601 har av ukjente årsaker vært svært utfordrende. Kombinasjon av Roche- og Illumina-sekvensering gav lav dekningsgrad, noe som gjorde det umulig å lage sammenhengende contiger. Ved prosjektets begynnelse hadde man en contig på 570 basepar. Denne inneholdt det strukturelle genet for bakteriocinet leucocin H. I løpet av dette prosjektet har man, ved hjelp av invers PCR med bruk av megaprimer, klart å finne hittil ukjent genomsekvens, og oppnådd større dekningsgrad for sekvensdata. Dette gjorde det mulig å utvide det 570 bp lange contigen til 4,5 kilobaser. Ved sekvenssøk og blastsøk, fant man åpne leserammer for andre gener som er nødvendig for bakteriocinproduksjon. Det ble gjort forsøk på å klone de 570 bp i en annen bakteriestamme, som også hadde evnen til å produsere sirkulære bakteriociner. Denne stammen, Lactococcus garviaeae, overlevde ikke ved kloning av disse 570 bp. Trolig førte produksjon av Leucocin H til at de klonede cellene av Lactococcus garviaeae døde. Grunnen til dette kan være mangel på immunitet som følge av at man ikke har hele genklyngen for leucocin H. Ved kloning av de 4,5 kb overlevde Lactococcus garviaeae, noe som tydet på at genet for immunitet er en del av den identifiserte sekvensen. Mikrotiterassay viste at de transformerte cellene gav nedsatt produksjon av bakteriocin, sammenlignet med vildtypen. Egenskapene til leucocin H ble testet ved ulike bakteriocinassay, og man så hemming av Lactobacillus sakei og Lactococcus lactis subsp. cremoris. Optimal pH for bakteriocinproduksjon lå på 7,0 i 25C. Ved testing av bakteriocinets effekt mot de Gram negative artene Escherichia coli, Morganella morganii og Proteus mirabilis, kunne man se en hemming der hvor forholdene lå best til rette for vekst av Leuconostoc. På grunnlag av den observerte hemmingen av de Gram negative artene, ønsket man å teste om leucocin H kunne ha en hemmende effekt på uønsket oppvekst av arter av familien Enterobacteroaceae på Ridderost. Man kunne ikke se noen sterk effekt av bakteriocinet. Denne delen av prosjektet ble gjennomført i samarbeid med TINEs meierier i Tresfjord.

Leuconostoc gasicomitatum is one of several bacteriocin producing lactic acid bacteria. In this specie one has discovered production of the circular bacteriocin leucocin H. This bacteriocin has shown activity against several species; among these are Listeria monocytogenes, Clostridium perfringens and Bacillus cereus. A full genome sequencing of the strain Leuconostoc gasicomitatum LMGT 3601 has, for unknown reasons, been a huge challenge. Combination of Roche- and Illumina-sequencing gave a very low coverage, which made it impossible to create a contig. At the beginning of this project, a contig of 570 base pairs was known. This segment of base pairs contained the structural gene for the bacteriocin leucocin H. During this project, one have, by the use of en inverse PCR with a megaprimer, on restriction cut ant self-ligated DNA, managed to identify unknown sequence, and attained a better coverage for the sequence data. This made it possible to expand the segment of 570 bp to a larger contig of 4,5 kilo bases. By searching in several databases, and doing some blasting, one found open reading frames that showed some similarity to other genes encoding proteins nessesary for bacteriocin production in other bacteria. One attempted to clone the 570 bp into another bacterial strain, which also had the ability to produce circular bacteriocins. This strain, a strain of Lactococcus garviaeae, did not survive the after having received the 570 bp into its genome. This was probably due to the production of leucocin H, which without the production of a dedicated immunity protein. By cloning all the 4,5 kb into the genome of Lactococcus garviaeae, the transformants survived, which leads to the allegation that the 4,5 kb encodes the immunity protein. A bacteriocin assay showed that the transformed cells had a significantly lower production of bacteriocin, compared to the wild type. The properties of leucocin H was characterized by several bacteriocin assays. It was shown activity against strains of Lactobacillus sakei and Lactococcus lactis subsp. cremoris. The optimal pH for bacteriocin production was 7,0 in 25C. By testing the effects of the bacteriocin against the Gram negative species Escherichia coli, Morganella morganii and Proteus mirabilis, one could see some inhibition of the growth. However, there was observed only when the environment favored growth of Leuconostoc gacicomitatum. Because of the observations regarding inhibition of growth of Gram negative species, one wished to investigate the effects of leucocin H on unwanted growth of species of Enterobacteroaceae on the surface-ripened cheese, Ridderost. No strong effect was observed. This part of the project was done in collaboration with the TINE dairies in Tresfjord.