Kan proteaser i næringsmidlar (mjølk) påverke utvikling av matvareallergi?

Abstract

Basofile granulocyttar har lenge vore kjent for deira funksjon som effektorceller i type 1 hypersensitivitetsreaksjonar. Nyare studie har vist at basofile granulocyttar kan indusere TH2-mediert immunrespons når dei er eksponert for allergen med cystein eller serinprotease aktivitet. Proteaseaktiverte reseptorar (PAR) er plasmamembranreseptorar som vert aktivert ved proteolytisk kløyving av serinproteaser. PAR er uttrykt av på både immunceller og andre celletypar som t.d. tarmepitelceller. Mjølk inneheld fleire serinproteaser, der plasmin er den som er best studert. Ei rekkje luftvegsallergen har vist seg å ha proteaseaktivitet, dei fleste studia på effekten av proteaseallergen på basofile granulocyttar er difor utført i ein modell for luftvegsallergi. Førekomsten av allergi mot matvarer aukar og i denne oppgåva vart det difor undersøkt om proteaser i næringsmidlar, og spesielt i mjølk kan utøve ei effekt på basofile granulocyttar og om denne effekten er mediert via PAR. I innleiande forsøk vart det isolert mRNA frå den basofile cellelinen KU812. Ved qPCR vart det påvist mRNA for PAR1, PAR2, PAR3 og PAR4. Det vart vidare påvist funksjonelle reseptorar for PAR1, PAR2 og PAR4 ved stimuleringsforsøk med spesifikke aktiverande peptid (AP) for desse reseptorane. Resultata viste at AP1, AP2 og AP4 induserte fosforylering av Erk. Det vart og utført stimuleringsforsøk med trypsin og plasmin på KU812 celler. Det vart vist at trypsin og plasmin induserte fosforylering av Erk i KU812 celler. Dette er det fyrste gong det vert undersøkt kva til effekt proteaser i mat har på basofile granulocyttar. Det vart og isolert basofile granulocyttar frå humant fullblod på to ulike måtar. Primære basofiler isolert ved gradientsentrifugering kombinert med positiv seleksjon med monoklonalt anti- FcεRI antistoff inneheldt mRNA for PAR1, PAR2 og PAR3. CD63 er ein markør som vert uttrykt av basofile granulocyttar etter at dei er aktivert . I basofilaktiveringstest er CD63 nytta som aktiveringsmarkør for å påvise IgE-medierte reaksjonar mot ulike allergen. Det vart difor undersøkt om stimulering med trypsin og plasmin induserte uttrykk i plasmamembranen av CD63 i KU812 og i primærceller. Resultata frå dette forsøket viste at trypsin og plasmin ikkje induserte uttrykk CD63. The role of basophils as effector cells during type 1 hypersensitivity reactions are well known. Recent studies have shown that basophils also can induce TH2 mediated immune responses when exposed to protease allergens. Protease activated receptors (PAR) belong to a family of G-protein coupled receptors that are activated by serine proteases. PAR is expressed in both immune cells and other cell types as human intestinal epidermal cells. Milk contains several serine proteases, of which plasmin is the best characterized among them. Most of the studies on the effects of protease allergens on basophils are preformed in a model mimicking airway allergy. In this project it was hypothesized that proteases from food also may exert an effect on basophils and that PAR may be the target molecule cleaved by these proteases. Introductory experiment showed that mRNA for all PAR receptors was expressed in the KU812 cell line. Stimulation with activating peptide for PAR1, PAR2 and PAR4 showed that the mRNA was expressed as functionally receptors in KU812. It was also performed experiments with trypsin and plasmin in which both were shown to activate Erk. This is the first experiment that elucidates the possible effect of food proteases on basophils. It was also isolated basophils from human whole blood in two different ways. Primary basophils isolated by gradient centrifugation combined with positive selection with monoclonal anti-FcεRI antibody expressed mRNA for PAR1, PAR2 and PAR3. CD63 is a membrane protein that is expressed by activated basophils. CD63 is used as an activation marker in basophil activation tests for detection of IgE-mediated reactions against different allergens. It was also preformed an experiment were the effect of stimulation of plasmin and trypsin on CD63 expression in KU812 cells and primary cells were investigated. The results from these experiments showed that trypsin and plasmin did not induce increased expression of CD63.