| dc.description.abstract | Denne oppgaven er skrevet som en del av større forskningsprosjekt hvor det overordnede målet er å utvikle enzymer som mest mulig effektivt degraderer den uløselige biopolymeren kitin (β-(1, 4)-bundet N-acetylglucosamine (GlcNAc)) og dets vannløselige analoge kitosan (delvis deacetylert kitin) til oligosakkarider av en gitt lengde. Siden kitin er veldig likt cellulose, som benyttes til produksjon av andre generasjons bioetanol, og de enzymatisk katalyserte hydrolyser av disse også er like er degraderingsstudier av kitin svært aktuelt.
Hovedmålet i studiet har vært å finne den best egnede metoden for måling av prosessivitet i familie 18 kitinaser, samt undersøke effekten åtte ulike mutasjoner har på den katalytiske mekanismen til kitinase B (ChiB) fra jordbakterien Serratia marcescens. I tillegg har enzymene blitt testet mot ulike substratvarianter da det er økende interesse for om andre faktorer enn enzymet selv, som for eksempel substrattilgjengelighet, kan påvirke grad av prosessivitet. Det har også blitt utført bindingsassay hvor målet var å undersøke om bindingsstyrken mellom enzym og substrat er proporsjonal forgrad av prosessiv katalyse.
Størrelsesekslusjonskromatografi, estimering av initiell hastighet for substratnedbrytning, apparent kcat, og viskositetsmålinger ble benyttet for måling av prosessivitet mot det løselige substratet kitosan hos de ulike enzymvariantene. Når substratet var kitin ble prosessivitet målt ved å bestemme konsentrasjon av resulterende dimerer etter hydrolyse delt på det samme for monomerer ([(GlcNAc)2]/ [GlcNAc] ratio). Samtlige analyser indikerte at mutantene F190A, W97A, W220A, W97A/ W220A og W97A/ D316A for ChiB har redusert prosessiviteten både mot kitin og kitosan. ChiB villype, samt mutantene R446 (deletering av det kitinbindende domene til ChiB), F191A og D316A viste prosessive egenskaper mot kitosan i samtlige analyser bortsett fra viskositetsmålinger for mutant D316A som ga avvikende resultater. R446 var prosessiv mot det vannløselige substrate kitosan, men hadde sterkt redusert prosessivitet mot det vannuløselige kitin som antyder at det kitinbindende domenet er viktigere for prosessiv hydrolyse av uløselige substrater. Resultatene viser derfor at kunnskap om degradering av løselig kitosan ikke alltid direkte kan overføres til degradering av krystallinsk kitin. Sammenligning av de ulike fremgangsmåtene for måling av grad av
prosessivitet antydet at størrelsesekslusjonskromatografi, estimering av apparent kcat og [(GlcNAc)2]/ [GlcNAc] ratioen er de best egnede metodene. Apparent kcat- verdier for de ulike enzymene viste og at ikke-prosessive enzymer var mer effektive mot løselig substrat enn de prosessive, og motsatt for uløselig substrat. Dette sammenfaller med tidligere forslag om at prosessive enzymer er mer effektive mot krystallinske substrater og mindre mot løselige substrater.
Degraderingsforsøk av ulike former for kitin med hensyn på substrattilgjengelighet (sonikert og ikke-sonikert) og med og uten hjelpeprotein (CBP21) ble også utført i nærvær av ChiB-WT og mutant R446 for å bestemme forholdet mellom substrattilgjengelighet og grad av prosessiv hydrolyse. En klar, positiv korrelasjon mellom substrattilgjengelighet og grad av prosessivitet ble observert. I tillegg var det en positiv korrelasjon mellom bestemte kcat- verdier og substrattilgjengelighet som videre bygger under teorien om at økende grad av prosessivitet fører til økning i aktivitet mot kitin.
Bindingsstyrken mellom enzym og kitin ble beregnet for ChiB-WT, R446, F190A, F191A, D316A, W97A og W97A/ W220A ved å måle dissosiasjonskonstanten, KD, og Gibbs frie energi, G, for samtlige dissosieringsreaksjoner. Alle enzymvariantene viste tilnærmet like verdier, uavhengig om de hydrolyserer kitin prosessivt eller ikke- prosessivt. Dette tyder på at enzymets affinitet for kitin ikke har noen direkte sammenheng med prosessivitet. Abstract
This paper is written as part of larger research project with the overall goal of developing enzymes that most efficiently degrades chitin (β-(1, 4)-bundet N-acetylglucosamine (GlcNAc)) and its water soluble analogue chitosan (partially deacetylated chitin) to oligosaccharides of a given length. Since chitin is very similar to cellulose which is used in production of second generation bioethanol, and the enzymatically catalyzed hydrolysis of these also is very similar, degradation studies of chitin is particularly relevant.
The main objective of the study was to determine the most suitable method for measuring processivity in family 18 chitinases and investigate the effect of eight different mutations on the catalytic mechanism of chitinase B (ChiB) from the soil bacterium Serratia marcsescens. In addition, enzymes have been tested against various substrates as there is an increasing interest in whether other factors than the enzyme itself, such as substrate accessibility, may affect the degree of processivity. There have also been carried out binding assays where the goal was to investigate if the binding strength between the enzyme and substrate is propotional to the degree of processive catalysis.
Size exclusion chromatography, estimating the initial rate of substrate hydrolysis, apparent kcat, and viscosity measurements were used for measuring processivity against the soluble substrate chitosan with the different enzyme variants. When the substrate was chitin, processivity was measured by determeting the concentration of the resulting dimers after hydrolysis divided by the same for monomers ([(GlcNAc)2]/ [GlcNAc] ratio). All of the analysis indicated that the mutants F190A, W97A, W220A, W97A / W97A and W220A / D316A for ChiB have reduced their processivity against both chitin and chitosan. ChiB wild type and the mutants R446 (deletion of the chitin binding domain to ChiB), F191A and D316A showed processive properties against chitosan in all analysis except for the viscosity measurements for the D316A mutant that gave abnormal results. R446 had a processive mode of action towards the soluble substrate chitosan, but showed strongly reduced processivity against the insoluble substrate chitin suggesting that the chitin binding domain is more important for processive hydrolysis of insoluble substrates. The results therefor indicate that knowledge of the degradation of soluble chitosan is not always directly transferable to the
degradation of crystalline chitin. Comparison of different methods for measuring processivity suggested that size exclusion chromatography, estimation of apperent kcat and the [(GlcNAc)2]/ [GlcNAc] ratio are the best suited methods. Apperent kcat-values for the different enzymes also showed that the non-processive enzymes were more effective against soluble substrate than processive enzymes, and vice versa for the insoluble substrate. This coincides with earlier suggestions that processive enzymes are more effective against crystalline substrates and less effective towards soluble substrates.
Degradation experiments with different types of chitin with respect for substrate accessibility (both sonicated and non-soincated) and with and without chitin- binding protein (CBP21) was also performed in the presence of ChiB wild type and mutant R446 to determine the relationship between substrate accessability and the degree of processivity. A clear, positive correlation between the substrate accessibility and the degree of prosessivitet was observed. In addition there was a positive correlation between specific kcat-values and substrate accessability which strengthens the theory that an increase in the degree of prosessivity will lead to an increase in activity towards chitin.
Binding strength between the enzyme and chitin were calculated for ChiB wild type, R446, F190A, F191A, D316A, W97A and W97A / W220A by measuring the dissociation constant, KD, and Gibbs free energy, ΔG, for all dissociation reactions. All enzyme variants showed approximately the same values, whether they hydrolyze chitin processive or non-processive way. This suggests that the enzyme's affinity for chitin does not directly relate to processivity. | en_US |
