Lipid and choline supply affect Atlantic salmon enterocyte steatosis : in vivo and in vitro studies

Abstract

The shift of farmed Atlantic salmon from a marine- to plant-based diet the last decades has revealed challenges concerning the dietary requirements necessary to ensure fish health. Of the nutrients lacking in plant feeds, choline has been identified as essential to guarantee efficient lipid transport and metabolism. The distinctive sign of choline deficiency is an excessive presence of unabsorbed fat accumulating within the intestinal enterocytes, a condition known as steatosis. The results of the first attempts to define choline requirement for post-smolt Atlantic salmon were published recently. However, it can be expected that choline requirements vary with life stages and environmental and dietary conditions, but information on such relationships is lacking. Besides being fundamental for lipid transport, choline has gained particular interest due to its important role in DNA methylation processes. So far, very little is known regarding the effects of variation in DNA methylation in fish, but it is likely that disturbances in methylation processes may lead to increased disease risk. In this thesis, two studies, resulting in three papers, were conducted to investigate how choline requirement in farmed Atlantic salmon may be influenced by different production conditions, and how dietary choline level may interfere with DNA methylation. However, our understanding of the cellular mechanisms responsible for nutrient interactions with fish digestive physiology is still fragmentary. To address this, the third study in this thesis focused on in vitro studies of lipid metabolism. This approach is an important tool to facilitate further research into the basic functions of the digestive tract.

In the first study, we investigated the effects of increasing dietary lipid levels on steatosis symptoms. This study involved Atlantic salmon parr that were fed choline-deficient diets. The fish were raised at two different environmental temperatures: 8 and 15 °C. The results showed that fish raised at 15 °C had higher feed intake and growth performances compared to those raised at 8 °C. Choline deficiency throughout all the diets induced steatosis in each experimental group. The increasing lipid level worsened the severity of the condition, as shown by the selected indicators i.e., the organosomatic index of the pyloric intestine (OSIPI), the enterocyte lipid accumulation, and the expression of the biomarker genes (plin2, apoAIV, apoAI and pcyt1α). Simultaneously, the severity increased with increasing water temperature, presumably as a consequence of the higher feed intake and therefore lipid supply to the fish. The fatty acid (FA) composition of the pyloric caeca mirrored that of the diets, while no clear effect was observed in the FA composition of the liver. Taken together, these results confirmed the importance of choline in lipid transport across the intestine, while demonstrating the relevance of dietary lipid level and water temperature as important drivers for intestinal lipid accumulation.

In the second study, we assessed the effects of lipid source on steatosis symptoms. This study involved two Atlantic salmon populations differing in size. Small fish showed higher feed intake and therefore growth performances compared to large fish. Simultaneously, the increasing level of rapeseed oil strongly influenced lipid digestibility and therefore lipid supply to the fish. The higher lipid supply, given by the increased feed intake and by the higher lipid digestibility, worsened the severity of enterocytes vacuolation. Total digestible FA increased with increasing rapeseed oil level in the diet. This result was clearest for mesenteric fat, followed by the pyloric intestine tissue and then by the liver. Taken together, these results were in accordance with the results from the first study and suggest that the lipid uptake is the main factor influencing steatosis symptoms.

The epigenetic study, which was based on samples collected in the first study, in which Atlantic salmon parr were fed four different diets with lipid levels increasing from 16% to 28%, and with insufficient choline content. Pairwise analyses of genome-wide DNA methylation patterns in pyloric caeca samples were conducted to compare different dietary impacts on the fish. The first comparison involved fish fed diets with 25% vs 16%, with similar, insufficient choline content, 1.9 g/kg feed. The second comparison focused on fish fed diets with substantial difference in choline levels (1.9 g/kg vs 2.3 g/kg), i.e., 22%, but with quite similar lipid content, 28 vs 25%. The results revealed that increasing dietary lipid level induced methylation differences in genes involved in membrane transport, signalling pathways, and microRNA important for regulation of lipid homeostasis. Increasing choline level affected genes related to FA biosynthesis and transport, lipolysis, lipogenesis as well as important immune genes. Our observations confirm the role of choline in epigenetic regulation in Atlantic salmon, as reported in other vertebrate groups.

The aim of the third study was to establish an in vitro steatosis model mimicking the lipid accumulation conditions observed in the Atlantic salmon intestine. A newly developed cell line derived from the distal intestine of the rainbow trout (RTdi-MI) was exposed to increasing concentrations of oleic acid (OA): 31.25 µM, 250 µM. Cells were sampled at 24 h, 72 h and 168 h (1 week) after exposure. The results showed that cell viability was not significantly influenced by the high concentration of OA or by exposure time. However, both factors affected the morphology of the cells. Cells became more rounded because of increasing intracellular lipid droplets (LD), which also compressed the cells’ nuclei towards the periphery of the cells. Such morphology resembles that of preadipocytes observed in other studies. The lipid quantification analysis confirmed not only that the cells accumulated OA in parallel to the OA exposure, but also that such accumulation increased with increasing exposure time. In addition, all cells, including the control cells, showed signs of fatty acid metabolic activity. The molecular results showed that, similar to what happens in vivo, all the cells expressed a set of genes involved in lipid metabolism and synthesis. The assessed genes were upregulated with increasing exposure time, and plin2 especially, which correlates with severity of steatosis in in vivo situations, was upregulated with increasing OA concentration in the medium. Taken together, these results confirm that RTdi-MI cells are able to accumulate OA and that their molecular mechanisms resemble those of the in vivo Atlantic salmon intestine.

In consideration of the role of choline in lipid transport and methylation processes, the present thesis generates new knowledge for the urgently needed studies defining choline requirement in Atlantic salmon for optimal growth and health. In addition, the conducted work has paved the way to study fish lipid metabolism on in vitro platforms.

Endringene i sammensetningen av fôr til laks i oppdrett de siste tiår, fra marine til vegetabilske ingredienser, har avdekket kunnskapsmangler når det gjelder tilførsel av næringsstoffer som sikrer god fiskehelse. Kolin er et av næringsstoffene som finnes i begrensende mengder i plantebaserte fôr, og som er essensielt for transport og metabolisme av fett. Det karakteristiske symptomet på kolinmangel er en unormal akkumulering av fett i tarmens enterocytter, en tilstand kjent som steatose. De første forsøkene som er gjennomført for å få kunnskaper om kolinbehovet hos postsmolt oppdrettslaks, ble nylig publisert. Det er sannsynlig at behovet varierer gjennom livsstadier hos oppdrettslaksen og påvirkes av miljømessige og fôringsmessige variasjoner, men kunnskap om slike forhold mangler. I tillegg til å være grunnleggende for fettransport, har kolin fått økt oppmerksomhet på grunn av sin viktige rolle i DNA-metyleringsprosesser, dvs epigenetiske prosesser. Hittil er lite kjent om effektene av variasjon i DNA-metylering hos fisk, men det er sannsynlig at forstyrrelser i metyleringsprosesser kan føre til økt sykdomsrisiko.

Dette doktorgradsarbeidet omfatter tre studier. To av disse, som er presentert i tre av artiklene i denne avhandlingen, hadde som mål å undersøke hvordan kolinbehovet hos oppdrettslaks kan påvirkes av ulike produksjonsforhold, og hvordan fôrenes kolininnhold kan påvirke DNA-metylering. Det tredje studiet hadde som mål å øke kunnskapene om cellulære mekanismer og næringsstoffers interaksjon med fiskens fordøyelsesfysiologi. I dette ble en in vitro-cellemodell for studier av lipidmetabolisme i fisketarm etablert. Denne modellen kan bli et viktig verktøy for videre forskning rundt de grunnleggende funksjonene i fiskens fordøyelsessystem.

I det første studiet ble effektene av økende fettinnhold, fra 16 til 28 %, i et fôr med mangelfullt innhold av kolin, på symptomer på steatose undersøkt hos parr av atlantisk laks som ble holdt ved to temperaturer: 8 og 15 °C. Resultatene viste, som forventet, at fisken ved 15 °C hadde høyere fôropptak og raskere vekst enn de ved 8 °C. Kolinmangelen i fôrene forårsaket steatose i alle forsøksgrupper. Økende fettinnhold i fôret forverret alvorlighetsgraden av tilstanden, som vist, for eksempel for organosomatisk indeks av pylorus-tarmen (OSIPI), lipidakkumulering i enterocyttene og uttrykket av biomarkørgener (plin2, apoAIV, apoAI og pcyt1α). Alvorlighetsgraden økte også med økende vanntemperatur, antagelig som en konsekvens av økt fôropptak og dermed økt lipidtilførsel til fisken. Fettsyresammensetningen i pylorus-blindsekker reflekterte fôret, mens det ikke ble observert noen tydelig effekt på fettsyresammensetningen i lever. Samlet sett bekreftet studien viktigheten av kolin for effektiv fettransport i tarm, samtidig som den viste at fettinnholdetet i fôr og vanntemperatur er viktige faktorer for alvorlighetsgraden av steatose i tarmen, og derved for kolinbehovet.

I det andre studiet ble effektene av andelen av fiskeolje og rapsolje i fôret, på symptomer på steatose indusert av kolinmangel studert. I denne studien inngikk to forskjellige populasjoner av atlantisk laks med forskjellig startvekt, smoltifiseringsforløp (S0 og S1), og genetisk bakgrunn. Disse populasjonene ble henholdsvis kalt liten og stor fisk. Liten fisk hadde høyere fôrinntak per kg kroppsvekt, og dermed høyere relativ tilvekst sammenlignet med stor fisk. Andelen rapsolje i fôret økte fettfordøyeligheten, og dermed fett-tilførselen, kraftig. Den høyere fett-tilførselen, som var resultat både av økt fôropptak og av høyere fettfordøyelighet, forverret alvorlighetsgraden av fettakkumuleringen i enterocyttene. Samlet sett var disse resultatene i samsvar med resultatene fra det første eksperimentet og antyder at fett-tilførsel er den viktigste faktoren for alvorlighetsgraden av steatosesymptomene.

Effekter av grad av kolinmangel på epigenetiske prosesser ble studert basert på prøver fra det første studiet, dvs fra parr av atlantisk laks fôret med fire forskjellige fôr med økende lipidnivåer fra 16 % til 28 %, og med utilstrekkelig tilskudd av kolin. To parvise analyser av genomvid DNA-metyleringsmønstre i prøver fra pylorus-blindsekker ble gjennomført. En for fisk som ble gitt fôr med 25 % og 16 % fett og likt, men utilstrekkelig kolininnhold, 1.9 g/kg, den andre for fisk som ble gitt fôr med forskjellig kolinnivåer (1,9 g/kg vs 2,3 g/kg), og relativt likt fettinnhold (28 vs 25%). Resultatene viste at økende innhold av fett i fôret resulterte i metyleringsendringer i noen gener involvert i membrantransport, signalveier, og mikroRNAer som er viktige for regulering av lipidhomeostase. Økende kolinivå påvirket gener for fettsyresyntese og transport, lipolyse og lipogenese samt viktige immungener. Disse observasjonene bekrefter rollen til kolin i epigenetisk regulering hos atlantisk laks, slik det er rapportert også for høyere virveldyr.

Målet med den tredje studien var å etablere en in vitro steatosemodell som kunne etterligne forholdene under lipidakkumuleringen i tarmsystemet hos atlantisk laks. En nyutviklet cellelinje fra baktarmen hos regnbueørret (RTdi-MI) ble eksponert for økende konsentrasjoner av oljesyre (OA): 31.25 µM og 250 µM. Celleprøve ble tatt 24, 72 og 168 timer (1 uke) etter eksponering. Resultatene viste at celleviabiliteten ikke ble betydelig påvirket, verken av den høye konsentrasjonen av OA, eller av eksponeringstiden. Imidlertid påvirket begge faktorene morfologien til cellene. Cellene ble mer avrundet på grunn av økende intracellulære lipiddråper (LD), og cellekjernene ble forskjøvet mot periferien av cellene. En slik morfologi ligner den som ses hos preadipocytter observert i andre studier. Kvantitative fettanalyser bekreftet at cellene akkumulerte OA som følge av OA-eksponeringen, og også at en slik akkumulering økte med økende eksponeringstid. I tillegg viste alle cellene, inkludert kontrollcellene, tegn til fettsyremetabolisme. De molekylære resultatene viste at cellene uttrykte et sett med gener involvert i lipidmetabolisme og -syntese på samme måte som det som skjer in vivo. De analyserte genene ble oppregulert med eksponeringstiden, og spesielt var plin2, som korrelerer med grad av steatose in vivo, oppregulert av økende OA-konsentrasjonen i cellemediet. Samlet sett bekrefter disse resultatene at RTdi-MI-celler er i stand til å akkumulere OA, og at deres molekylære mekanismer ligner de i tarmen til atlantisk laks.

Denne avhandlingen har generert ny og viktig kunnskap om kolins rolle i lipidtransport og metyleringsprosesser som er nødvendig for design av forsøk som må gjennomføres for å definere kolinbehov hos laks for optimal vekst og helse. I tillegg har arbeidet etablert en in vitro-plattform for videre studier av lipidmetabolisme i tarm hos fisk.

In natura, il salmone è un predatore che si ciba principalmente di altri pesci piu’ piccoli. Negli allevamenti tuttavia, oltre al pesce, il salmone atlantico viene nutrito con mangimi a base di soia, grano ed oli vegetali. Tuttavia questi alimenti sostitutivi risultano spesso carenti in alcuni nutrienti che hanno assicurato, finora, il benessere animale. La colina, essenziale per il trasporto e metabolismo lipidico, e’ tra quei nutrienti non sufficientemente presenti nei mangimi a base vegetale. L’inadeguato apporto di colina puo’ causare eccessivo accumulo di grasso all’interno degli enterociti, una condizione nota col nome di steatosi e comune in diverse specie. Uno studio condotto recentemente ha indicato il fabbisogno di colina necessario ad eliminare i sintomi di steatosi in salmoni in fase post-smolt. E’ tuttavia possibile che tale fabbisogno vari durante la vita dei salmoni, e che sia influenzato da fattori ambientali e nutrizionali. Oltre ad essere fondamentale per il trasporto lipidico, la colina ha guadagnato particolare interesse negli ultimi anni grazie al suo ruolo di donotare di gruppi metili durante i processi di metilazione del DNA. Le informazioni disponibili riguardo gli effetti della metilazione del DNA nei pesci sono molto limitate ad ora. E’ tuttavia possibile che un aumento di tali processi possa accrescere il rischio di malattie. Per la stesura di questa tesi sono stati condotti due esperimenti fini allo studio dei fattori che potrebbero influenzare il fabbisogno di colina, e alla ricerca dei possibili effetti della colina sulla metilazione del DNA. In aggiunta, un terzo esperimento in vitro e’ stato condotto col fine di studiare i meccanismi cellulari e molecolari responsabili delle interazioni tra metabolismo lipidico e fisiologia intestinale.

Nel primo esperimento, sono stati testati gli effetti del livello di lipidi nel mangime, in combinazione con la temperatura dell’acqua. I salmoni, in stadio evolutivo parr. sono stati cresciuti a due diverse temperature ambientali, 8 e 15 C°, e alimentati con tre diete contenenti un crescente livello lipidico, 16%, 20%, 25%. Tutte le diete contenevano un basso livello di colina. Il basso livello di colina ha indotto un’eccessivo accumulo lipidico nei cieci pilorici di tutti gli animali. Tale condizione e’ stata peggiorata dall’aumento del contenuto di grasso nel mangime, come testimoniato dai principali biomarkers di steatosi: l’indice organosomatico dei ciechi pilorici (OSIPI), il quantitativo di gocce lipidiche accumulate negli eneterociti e l’espressione di un gruppo di geni marker (plin2, apoAIV, apoAI e pcyt1α). Per quanto riguarda gli effetti della temperatura dell’acqua, i sintomi di steatosi sono stati aggravati a 15 C°, consequentemente ad un aumento di appetito e quindi di apporto lipidico causato dall’alta temperatura. Il profilo degli acidi grassi nei ciechi pilorici ha rispecchiato quello della dieta, mentre il fegato non ha riportato particolari effetti o differenze. Nel complesso questi risultati confermano il ruolo della colina nel favorire efficiente trasporto lipidico, e mettono in luce l’importanza del livello di grasso nel mangime e della temperatura ambientale come fattori influenzanti l’accumulo lipidico.

Nel secondo esperimento, salmoni atlantici provenienti da due allevamenti differenti, e aventi quindi diverso background, razza e taglia, sono stati alimentati con sei diete contenenti crescente livello di olio di colza e decrescente livello di olio di pesce. I pesci piu’ piccoli, avendo un maggiore appettito, hanno mostrato maggiori perfomance di crescita e un alto apporto lipidico rispetto ai pesci piu’ grandi. Allo stesso tempo, il crescente livello di olio di colza ha incrementato la digeribilita’ dei grassi, incrementando l’apporto lipidico. Il crescente apporto lipidico, dato sia da una maggiore assunzione di cibo che dall’alta digeribilita’ dei grassi ha contribuito ad aggravare i sintomi di steatosi. Nel complesso questi risultati confermano, ancora una volta, che l’apporto lipidico e’ imprincipale fattore influenzante l’accumulo di grasso nei ciechi pilorici.

Nel terzo esperimento, salmoni atlantici in stadio parr sono stati alimentati con quattro diete contenenti un crescente quantitativo di grasso, dal 16% al 28%, ed insufficiente apporto di colina, compreso tra 1820 g/Kg e 2310 g/Kg. Le due diete conteneti il piu’ alto e il piu’ basso livello di grassi e simile livello di colina (16% vs 25%) sono state analizzate ai fini di mettere in luce gli effetti dei grassi sul metiloma intestinale degli animali. Allo stesso modo, le due diete contenenti simile livello lipidico ma differente livello di colina (1940 g/Kg vs 2310 g/kg) sono state analizzate ai fini di verificare se la colina avesse indotto metilazione del DNA nei ciechi pilorici. Il pi’ alto apporto lipidico ha indotto la metilazione di alcuni geni responsabili del transporto di membrana, pathways di signalling e microRNA. Il diverso livello di coline nella dieta, invece, ha indotto l’ipometilazione di geni coinvolti nella sintesi e transporto degli acidi grassi e nella lipolisi e lipogenesi. In aggiunta, anche alcuni geni regolatori della risposta immunitaria sono stati influenzati dal livello di colina. Nel complesso, questo studio conferma il ruolo della colina nella regolazione dei processi di metilazione del DNA nel salmone atlantico, come dimostrato per altre specie di vertebrati.

Nel quarto esperimento descritto in questa tesi, una nuova linea cellulare ottenuta dall’intestino distale della trota iridea e’ stata esposta ad un crescente livello di acido oleico (31.25 e 250µM) per un periodi di 24, 72 e 168h (1 settimana) col fine di produrre un modello in vitro di steatosi e studiare l’accumulo e il metabolismo lipidico. Prima di tutto, i risultati hanno mostrato che l’acido oleico non influenza in modo significativo la vitalita’ cellulare. Tuttavia, in parallelo all’aumento dell’acido oleico nel medium di coltura, le cellule hanno accumulato un crescente quantitativo di gocce lipidiche e granuli di stress nel citoplasma. Tale accumulo lipidico ha influenzato la forma e dimensione delle cellule, che dopo 168h alla piu’ alta esposizione di acido oleico erano diventate rotonde e con un’area molto elevata. L’accumulo lipidico e’ confermato dai risultati della quantificazione degli acidi grassi. I risultati mostrano infatti che la concentrazione di acido oleico al quale le cellule sono state esposte rispecchia il quantitativo di acido oleico ritenuto dalle stesse. In aggiunta, la totalita’ degli acidi grassi all’interno delle cellule era maggiore nei fosfolipidi e trigliceridi rispetto agli acidi grassi liberi, dimostrando un tentativo, da parte delle cellule, di produrre lipoproteine. Dal punto di vista molecolare, i nostri risultati hanno dimostrato che le RTdi-Mi possiedono gli stessi geni coinvolti nel metabolismo lipidico delle trote iridee in vivo. In secondo luogo, l’espressione genica conferma non solo una relazione dose-risposta tra plin2, importante gene coinvolto nella formazione delle gocce lipidiche, e il livello di acido oleico nel medium; ma anche un aumento dell’espressione di tutti i geni in risposta al crescente tempo in coltura. Questi risultati dimostrano che linee cellulari di intestino possono essere usate per riprodurre le stesse dinamiche di accumulo lipidico che avvengono in vivo.

Considerando l’importante ruolo della colina nel trasporto lipidico e nei processi di metilazione, la presente tesi offre nuove informazioni da applicare a lavori futuri. Inoltre, l’esperimento condotto in vitro rappresenta il primo passo verso lo studio del metabolismo lipidico dei pesci su piattaforme in vitro.