Molecular dissection of the role of plant hormones in perennial shoot branching

Abstract

Shoot architecture in deciduous trees is determined by the apical meristems and the lateral branching. The formation of above-ground architecture perennials is regulated by a complex spatial-temporal regulation. For decades, intensive research has focused on the identification and characterization of phytohormones that are involved in controlling the complex shoot branching mechanism. This process is governed by a complex hormonal network that forms a strong foundation for understanding the molecular basis for shoot branching. Although, enormous amount of work has been conducted in understanding the mechanism of shoot branching in annuals, very little is known about the molecular process regulating that control branching in woody perennials. The thesis includes three separate studies. The overall aim has been to provide insights on the knowledge gap related to the role of strigolactone (SL) and gibberellin (GA) along with other interacting hormone pathways in regulating shoot branching in the model perennial woody species (Hybrid aspen). In paper I, the presence and the role strigolactone pathway genes in hybrid aspen was investigated. Previous studies have shown the presence of SL pathway genes in annuals but very little was known about the involvement of SL pathway in perennials. For the first time in perennials, we detected the presence of DWARF27 (D27), LATERAL BRANCHING OXIDOREDUCTASE (LBO) and DWARF53-like (D53-like) along with the indepth understanding of the presence of all the SL pathway gene in above and below ground tissues. The most important finding of this paper was that SL biosynthesis genes MORE AXILLARY GROWTH3 (MAX3) and MAX4 expressed in high levels in nodal bark rather than AXBs and AXBs expressed high level of SL perception and signaling genes (MAX2, D14 and D53) indicating that SL and its precursors are transported from node to AXBs in perennials instead of long-distance transport from roots to axillary buds (AXBs). AXB activation induced by decapitation downregulated most of the genes downstream of MAX4 apart from LBO. In order to specifically understand the role of SL in AXB inhibition, GR24-feeding inhibited the AXB outgrowth once the activation has started, and SL helps to preserve the AXBs in quiescent state until the next growing season by restraining embryonic shoot elongation during the formation of AXBs. Along with SL, both nodes and AXBs also produced GA which may work mutually in promoting AXB activation by overtaking the effects of SL (paper II). Contrary to the view that GA are branch-inhibitors, our data show that they promote shoot branching. Comprehensive transcript and metabolite studies decoded the role of GA in AXB activation and outgrowth by rapidly reducing deactivation gene GA2ox. This suggests an increase in the GA pool through downregulation of GID1 signaling gene. On the other hand, GA3ox2-mediated de novo biosynthesis supports AXB elongation and branch formation. Like SL, nodes support the supply of GA precursors from nodes to AXBs. We could show through the combination of metabolite and transcript analysis that GA3/6 produced in the quiescent AXBs targets GA1/4 through GA2ox mediated deactivation. The study on SL and GA interaction reveal that both the pathways are entangled and confirmed that GA-deactivation is the effective way to regulate GA levels. In paper III, by employing the first ever de novo transcriptome analysis in hybrid aspen, we identified the early molecular responders to AXB activation. We analyzed the global overview of Auxin, Cytokinin, Abscisic acid, Jasmonic acid, Salicylic acid, Brassinosteroids pathway genes at different time points post-decapitation along with validating the SL and GA genes studies in Paper I and II. Our data provided a comprehensive understanding as well as a starting point to understand the previous untouched hormonal pathways in studying shoot branching in perennial woody species. In conclusion, PhD work has shown the molecular dissection of the role of various plant hormonal pathways involved in shoot branching in perennial woody species, hybrid aspen.

Skuddarkitektur hos løvtrær bestemmes av det apikale skuddmeristemet og forgreining av sideskudd. Reguleringen av forgreining er kompleks i tid og rom. I mange tiår har forskning satt søkelyset på å identifisere plantehormoner som kontrollerer denne komplekse mekanismen. Det er i dag kjent at prosessen styres av et nettverk av plantehormoner som igjen danner grunnlaget for den molekylære reguleringen. Forskning på mekanismer som styrer forgreining har imidlertid frem til nå hovedsakelig omfattet ettårige planter. Forståelsen av mekanismene og den molekylære prosessen som regulerer forgrening hos flerårige, treaktige planter er derfor lite er kjent. Det overordnede målet i denne avhandlingen var å gi innsikt i rollen til plantehormoner, spesielt med fokus på strigolakton (SL) og gibberellin (GA), hvordan de samspiller med andre hormoner, og regulerer forgreining hos treaktige planter. Avhandlingen består av tre separate artikler der den flerårige treaktige arten hybridosp (Populus tremula × Populus tremuloides) er benyttet som modellplante. I artikkel I ble uttrykket og rollen til gener involvert i «SL-veien» undersøkt. RNA ble sekvensert fra avkuttede sideknopper for å studere de molekylære endringene som skjer ved slik avkutting. Tidligere studier har vist uttrykk av SLbiosyntesegener hos ettårige planter, men svært lite er kjent hos flerårige planter. For første gang ble det påviste uttrykk av gener i «SL-veien» i hybridosp. Resultatene viste uttrykk av genet DWARF27 (D27), LATERAL BRANCHING OXIDOREDUCTASE (LBO) og DWARD53-lignende (D53-lignende) i tillegg til å gi innsikt i tilstedeværelsen av alle genuttrykk i SL-veien, både i overjordisk og underjordisk vev. Det viktigste funnet i denne artikkelen var at SLbiosyntesegenene MORE AXILLARY GROWTH3 (MAX3) og MAX4 var høyt uttrykt i nodiebark i stedet for sideknopper. Sideknopper viste høyt uttrykk av SL-persepsjons- og signalgener (MAX2, D14 og D53) som indikerer at SL og SL-forløpere transporteres fra nodier til sideknopper i stedet for at det skjer langdistansetransport fra røtter til sideknopper. Aktivering av sideknopper, indusert ved avkutting av toppskudd, nedregulerte de fleste gener nedstrøms for MAX4 bortsett fra LBO. For å forstå rollen til SL i sideskuddhemming ble sideknopper behandlet med GR24, en syntetisk SL analog. Veksten til sideknoppene, etter avkutting av toppskuddet, ble hemmet av GR24. Dette viser av SL bidrar til å holde sideknoppene i en «hvilende tilstand» til neste vekstsesong ved å hemme strekningsveksten hos embryonale skudd. Sammen med SL, produserer både nodier og sideknopper GA, som kan fremme aktivering av sideknopper ved å overta for SL (artikkel II). I motsetning til tidligere teorier om at GA hemmer sideskuddforgreining, viste våre resultater at GA fremmer forgreining (artikkel II). Omfattende transkripsjons- og metabolittstudier tydeliggjorde rollen til GA i aktivering og vekst av sideskudd ved raskt å redusere transkripsjonen av GA-de-aktiveringsgenet GA2ox. Dette antyder en økning i «GA-poolen» ved nedregulering av GA-signaleringsgenet GID1. På den annen side, GA3ox2-mediert de novo biosyntese er involvert i bryting og vekst av sideknopper. I likhet med SL, tilføres GA-forløpere fra nodiene til sideknoppene. Metabolitt- og transkripsjonsanalyser viste at GA3/6 produsert i de hvilende sideknoppene påvirker GA1/4 - deaktivering ved å stimulere GA2ox. Studien av samspillet mellom SL og GA viser at begge «veier» er koblet og studien bekrefter at deaktivering av GA er en effektiv måte å regulere GAnivået i sideknopper. I artikkel III ble det, for første gang med hybridosp som modell, gjennomført en de novo transkriptomanalyse. Vi identifiserte tidlige molekylære endringene i respons på aktivering av sideknopper. Resultatene ga en oversikt over plantehormonene auxin, cytokinin, abscisinsyre, jasmonsyre, salisylsyre, samt gener i «brassinosteroid-veien» på forskjellige tidspunkt etter avkutting i tillegg til å validere SL- og GA-gen-studiene i artikkel I og II. Resultatene bidro til en større forståelse for de hormonelle veiene som hittil ikke har vært undersøkt men som regulerer skuddforgrening i flerårige trearter. Denne avhandlingen har gitt ny kunnskap, og klargjort forskjellige hormonelle veier involvert i skuddforgrening hos flerårige trearter.