Exploring physiological functions of the prion protein in a new animal model

Abstract

The cellular prion protein (PrPC) has been intensively studied for its role in the pathogenesis of transmissible spongiform encephalopathies, such as Creutzfeldt-Jakob disease in human, bovine spongiform encephalopathy in cattle and scrapie in sheep and goat. Although their causative agent has been identified in the misfolded isoform of the protein, PrPSc, the physiological role of PrPC is still unclear. PrPC is conserved throughout vertebrates, and is expressed in the central nervous system and immune-privileged organs such as ovaries, testes, eye, and placenta. Several lines of Prnp knockout mice have been developed in order to study its functions. These mice develop healthy and are resistant to prion disease. Through their utilization, several roles of PrPC have been proposed, such as cell protection against stressors, metal homeostasis, and regulation of circadian rhythm, among others. We studied the role of PrPC and some phenotypes characterized in mice, with a new animal model, Norwegian dairy goats naturally lacking prion protein due to a stop mutation in the prion protein gene (PRNPTer/Ter). We investigated transcriptomic differences in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) isolated from goats expressing PrPC and in PRNPTer/Ter goats. We identified a primed state of interferonstimulated genes in goats lacking PrPC, suggesting a role for the protein in the dampening of immune responses. We also studied the cytoprotective role of PrPC in goats’ spermatozoa and PBMCs after exposure to stressors. Spermatozoa were exposed to copper ions, and their viability, motility, and adenosine triphosphate (ATP) levels were measured. Moreover, oxidative stress was induced with FeSO4 and H2O2, and the levels of reactive oxygen species (ROS) were measured. PBMCs and a neuroblastoma cell line were also used and the effect of stressors were measured in these cells. We could not detect a stress-protective effect of PrPC in vitro. Our results questioned the in vitro stress-protective role of PrPC . In addition, we carried out morphological analysis of peripheral nerves of goats to investigate a putative function of PrPC in myelin maintenance. We analysed teased fibres, and cross sections of nerves and we identified ultrastructural changes suggesting demyelinating pathology. Moreover, macrophages and T cells infiltrating the nerve were detected. Analysis of peripheral nerve lipid composition revealed significant differences between adult goats with or without PrPC. Such difference was not detected between groups of young goats, indicating a progression of the pathological condition with age. Taken together our results provided evidence of progressive demyelinating pathology in goats lacking prion protein. Altogether, in this thesis we have explored different physiological functions of PrPC. Future research is needed to fully understand PrPC function and the use of a nontransgenic animal model can provide useful advantages to increase the knowledge on this protein.

Det cellulære prionproteinet (PrPC) er grundig studert på grunn av dets viktige rolle i utviklingen av overførbare spongiforme encefalopatier, som Creutzfeldt-Jakobs sykdom hos menneske, bovin spongiform encefalopati hos storfe og skrapesyke hos sau og geit. Selv om en feilfoldet variant av proteinet, PrPSc, er årsak til disse sykdommene, er den normale funksjonen til PrPC fortsatt ukjent. PrPC er konservert blant virveldyr og uttrykt i sentralnervesystemet og såkalte immunprivilegerte organer som ovarier, testikler, øye og placenta. Det er utviklet flere linjer av transgene mus hvor genet som koder for PrPC, Prnp er fjernet eller inaktivert (knockout). Gjennom studier av disse muselinjene har man oppdaget mange PrPC-funksjoner for eksempel; beskyttelse mot stress og regulering av metallhomeostase og døgnrytmer. Vi har studert PrPC sine mulige funksjoner i en ny dyremodell, nemlig en linje av Norsk melkegeit som på grunn av en naturlig forekommende «stoppmutasjon» (PRNPTer/Ter) fullstendig mangler PrPC. Vi har studert forskjeller i genuttrykk (transkripsjon) i perifere blod mononukleære blodceller (PBMC) hos geiter med og uten uttrykk av PrPC. Gjennom disse studiene påviste vi at en gruppe interferon-stimulerte gener var mildt oppregulert hos geitene uten PrPC, noe som tyder på at PrPC kan ha en immundempende funksjon. Vi har også studert PrPCs cellebeskyttende funksjoner hos spermier og PBMC’er fra geiter gjennom å utsette celler for ulike former for stressbelastninger. Spermier ble utsatt for kobberioner og cellenes levedyktighet, motilitet (bevegelse) og adenosin trifosfat (ATP) nivåer ble målt. Videre utsatte vi cellene for oksidativt stress gjennom eksponering for jernsulfat (FeSO4) og hydrogenperoksid (H2O2) og vi målte nivåene av reaktive oksygenspecies (ROS). PBMC’er og en human neuroblastom cellelinje ble også benyttet i disse studiene og effektene av stressbelastningene ble sammenlignet hos celler med og uten uttrykk av PrPC. Våre forsøk in vitro (i reagensglass-forsøk) viste ingen forskjell mellom cellenes evne til å tolerere stress om PrPC ble uttrykt eller ikke. Våre resultater stiller spørsmål ved enkelte tidligere publiserte rapporter som har vist en stressbeskyttende funksjon av PrPC i lignende forsøk. I tillegg har vi gjort detaljerte studier av perifere nerver hos geiter med og uten PrPC, for å undersøke om det også hos geit, som hos mus, er tegn til nerveskade (skade av myelinskjedene som omslutter nervene) hos dyr uten PrPC. Vi har analysert isolerte nervefibre med en metode hvor disse trekkes fra hverandre (teasing). Gjennom histologiske snitt av nerver og ved elektronmikroskop har vi kunnet påvise tap av myelinskjeder, en såkalt demyeliniserende nevropati. Videre påviste vi infiltrasjon av immunceller, som makrofager og T celler i nervene. Undersøkelser av fettstoffer (lipidanalyse) fra perifere nerver fra voksne geiter med og uten PrPC viste store forskjeller mellom gruppene, noe som indikerer en gradvis forverrende tilstand hos geitene uten PrPC. Disse funnene underbygger hypotesen om at PrPC har en viktig rolle i vedlikeholdelse av myelinskjedene rundt perifere nerver. Samlet sett har arbeidene i denne avhandlingen belyst ulike mulige fysiologiske roller til PrPC. Flere viktige observasjoner er gjort, men videre undersøkelser er nødvendig for å frembringe detaljert kunnskap om hvordan PrPC utfyller sine fysiologiske funksjoner i kroppen. Våre studier har vist at den ikke-transgene dyremodellene geitene representerer har vært meget nyttig og at potensialet for videre bruke av denne dyremodellen er stort.