Medaka (Oryzias latipes) gonadotropins : production and developmental profiles, pharmacological characterization of their receptors, and establishment of a novel transgenic line tg(fshb:DsRed2)

Abstract

The gonadotropins, follicle-stimulating hormone (Fsh) and luteinizing hormone (Lh), produced in gonadotrope cells of the pituitary, possess key roles in the endocrine control of vertebrate puberty and reproduction as part of the brain–pituitary–gonad (BPG) axis. To get a broader understanding of the specific functional roles of gonadotropins in fish, particularly Fsh for which information is scarce, I first generated recombinant medaka gonadotropins Fshβ, Lhβ, Fshβα, and Lhβα produced by Pichia pastoris, and specific antibodies against Fshβ and Lhβ raised in rabbits. These tools were used to develop and validate immunofluorescence (IF) protocols for the localization of Fshβ and Lhβ producing cells, and also enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for the quantification of Lh and Fsh at the single pituitary level. For gonadotrope cell localization, I compared IF using the generated antibodies against Fshβ and Lhβ, with fluorescent in situ hybridization (FISH) using probes complementary to fshb and lhb in adult medaka. The results highlighted cells expressing Lhβ and lhb to be located in the ventral part of the pituitary, and Fshβ and fshb expressing cells mainly to be present from the ventral to the dorsal part, being more widely distributed than the lhb expressing cells. Lh and Fsh protein content in male medaka pituitaries during pubertal development was compared to mRNA expression levels of fshb and lhb using qPCR. The findings highlighted that both Lh and Fsh protein amounts increased during pubertal development. Correspondingly, lhb mRNA levels increased significantly with maturation, while Fsh receptor (fshr) and Lh receptor (lhr) mRNA levels in testes were also demonstrated to increase. A pharmacological characterization revealed each gonadotropin activating its own cognate receptor, as well as partial ligand promiscuity and cross-species reactivity between medaka and Nile tilapia ligands and receptors. To provide a sensitive method for tracking fshb expression during development, and enabling studies on the functional roles of Fsh, I developed a medaka transgenic line tg(fshb:DsRed2) expressing red fluorescent protein under control of the endogenous fshb promoter. Interestingly, the first sign of DsRed2 expression was observed at 8 dpf (days post-fertilization), suggesting a functional role for fshb during early development. The Fsh cell number increased gradually with development. Together with our previously generated tg(lhb:hrGfpII) line, this line will provide a valuable tool for studies on gonadotropin regulation. Altogether, this thesis has contributed in generating key tools by developing IF-, FISH-, and ELISA-protocols, and a medaka fshb transgenic line, which will enable further studies on the localization and quantification of Fsh and Lh at both mRNA and protein level, and hereby advance our understanding of gonadotropin functions in fish.

De to gonadotropinene follikkelstimulerende hormon (Fsh) og luteiniserende hormon (Lh) blir produsert i hypofysens gonadotrope celler og besitter viktige roller i den endokrine kontrollen av pubertet og reproduksjon hos vertebrater som en del av hjerne-hypofyse-gonade (BPG) aksen. For å øke forståelsen for de spesifikke funksjonelle rollene til gonadotropiner i fisk, spesielt gjelder dette Fsh der informasjon er mangelfull, har jeg i min PhD-avhandling laget rekombinante gonadotropiner Fshβ, Lhβ, Fshβα og Lhβα fra japansk risfisk, eller medaka (Oryzias latipes). De fire proteinene ble produsert i celler av gjærsoppen Pichia pastoris. Spesifikke antistoffer mot Fshβ og Lhβ ble produsert i kaniner, og validert ved hjelp av Western blot og immunfluorescens (IF) hvor Fshβ- og Lhβ-produserende celler i hypofyse til medaka ble lokalisert. For lokalisering av gonadotrope celler sammenlignet jeg IF ved bruk av de produserte antistoffene mot Fshβ og Lhβ, med fluorescerende in situ hybridisering (FISH) ved hjelp av prober komplementære til fshb og lhb. Resultatene viste at celler som uttrykker Lhβ og lhb er lokalisert i den ventrale delen av hypofysen, mens Fshβ og fshb er uttrykt i celler som er lokalisert fra ventral til dorsal side, mer spredt enn de lhb-uttrykkende cellene. Antistoffer og rekombinante proteiner ble videre brukt til å validere enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for kvantifisering av Fsh og Lh i enkelthypofyser. Innholdet av Fsh- og Lh-protein i hypofyser fra hannmedaka under pubertetsutviklingen ble sammenlignet med mRNA-nivåer av fshb og lhb ved bruk av qPCR. Resultatene viste at nivå av både Fsh- og Lh-protein økte gjennom pubertet. Tilsvarende økte lhb mRNA-nivåer signifikant med modning, mens fshb viste liten endring. Genuttrykket av reseptorene til Fsh og Lh (henholdsvis fshr og lhr) ble undersøkt i testikkelvev og disse økte også gjennom pubertetsutviklingen. En farmakologisk karakterisering avdekket at hvert gonadotropin aktiverte sin egen reseptor, i tillegg til å utvise delvis ligand-promiskuitet til den andre gonadotropinreseptoren. Videre ble det avdekket interartsreaktivitet mellom medaka og tilapia (Oreochromis niloticus) sine ligander og reseptorer. For å få en sensitiv metode som kan detektere uttrykket av fshb under utviklingen, samt muliggjøre studier av Fsh sine funksjoner, utviklet jeg en transgen linje for medaka, tg(fshb:DsRed2), der rødt fluorescerende protein ble produsert under kontroll av den endogene fshb-promotoren. Interessant nok var det første tegnet på DsRed2 uttrykk observert 8 dager etter befruktning, noe som tyder på en funksjonell rolle for fshb under tidlig utvikling. Antall Fsh-produserende celler økte gradvis med utviklingen. I kombinasjon med vår tidligere genererte linje, tg(lhb:hrGfpII), vil denne linjen gi et verdifullt verktøy for studier av gonadotropinregulering i medaka. Samlet har denne oppgaven bidratt til å videreutvikle nøkkelverktøy, som IF-, FISH- og ELISA-protokoller, samt en medaka fshb transgen linje, som muliggjør videre studier på lokalisering og kvantifisering av Fsh og Lh både på mRNA- og proteinnivå, og dermed bedre vår forståelse av gonadotropinfunksjonen i fisk.