Bruk av CRISPR interferens til å studere gener i Staphylococcus aureus som er viktige for interaksjon med bakterier i jurmikrobiotaen

Abstract

Staphylococcus aureus er et av de hyppigste årsakene til utvikling av bovin mastitt, som er en av de mest utfordrende sykdommene hos melkekyr på verdensbasis. Mastitt forårsaker problemer som redusert helsetilstand hos kyrene, kostnader til behandling, økt antibiotikabruk, tidligere slakting, reduksjon i melkeproduksjon, dårlig melkekvalitet, redusert produktkvalitet og matsvinn. For å redusere disse store økonomiske tapene i meieriindustrien må nye effektive metoder for forebygging og behandling av mastitt utvikles. En bedre innsikt i infeksjonsprosessen til mastittpatogener i juret kan bidra på veien til dette. I dette arbeidet ble gener i S. aureus som er viktige for interaksjon med andre bakterier i jurmikrobiotaen studert ved bruk av CRISPR interferens (CRISPRi). Ved CRISPRi kan gener nedreguleres og endring av bakteriens fitness som følge av nedreguleringen kan bestemmes. For å kunne studere dette, ble det her utviklet en metode for kokultivering av et S. aureus CRISPRi-genomskalabibliotek med jurmikrobiotabakterier, før et kokultiveringsforsøk og CRISPRi-sekvensering (CRISPRi-seq) ble utført. CRISPRi-systemet ble vist å være funksjonelt i UHT-melk, et vekstmedium som likner miljøet i jurmikrobiotaen, som var en forutsetning for å kunne utføre kokultiveringsforsøket. I den utviklede kokultiveringsmetoden ble S. aureus CRISPRi-biblioteket dyrket sammen med jurmikrobiotabakterien Streptococcus dysgalactiae med en 1:8 inokuleringsratio av bakteriene. Genfitnessanalyse fra CRISPRi-seq viste to gener som var mer essensielle under kokultiveringen med S. dysgalactiae sammenliknet med S. aureus dyrket alene (glnR og pyrG), og to mindre essensielle gener (htsA og fhuC). glnR og pyrG assosieres med biosyntese og omdannelse av glutamin mens htsA og fhuC assosieres med jernopptak. CRISPRi-seq av kokultiveringsforsøket viste få gener med signifikant forskjell i genfitness for S. aureus dyrket alene og dyrket med S. dysgalactiae, noe som kan skyldes lite interaksjon mellom bakteriene. Dette tyder på at metoden utviklet her kan forbedres ved å bedre legge til rette for interaksjoner i kokultiveringen i fremtiden. CRISPRi-seq er en screening metode og i fremtiden bør også disse resultatene valideres med for eksempel vekstforsøk med ‘knockout’ mutanter eller ved å undersøke individuelle CRISPRi-stammer med de mer og mindre essensielle genene nedregulert av sgRNA. Dette vil danne grunnlag for å videre forstå hvordan S. aureus påvirkes ved kokultivering med S. dysgalactiae.

Staphylococcus aureus is a major cause of bovine mastitis, which is one of the most challenging diseases in dairy cows worldwide. Mastitis leads to issues like reduced animal health, treatment costs, increase in usage of antibiotics, early culling, reduced milk production, reduced milk quality, reduced product quality and spoilage. New and more efficient methods to prevent and treat mastitis needs to be developed to reduce these major economic losses in the dairy industry. A better insight of the infection process of mastitis pathogens in the udder can contribute to this goal. In this work, S. aureus genes important for interaction with other bacteria in the udder microbiota was studied with the use of CRISPR interference (CRISPRi). Genes can be downregulated with CRISPRi, and change in fitness of the bacteria due to this downregulation can be determined. To be able to study this, a method for cocultivation of a S. aureus CRISPRi genome wide library with udder microbiota bacteria was developed, before a cocultivation experiment and a CRISPRi sequencing (CRISPRi-seq) was performed. The CRISPRi system was shown to be functional in UHT-milk, a growth medium that resembles that of the udder, with was a prerequisite to conduct the cocultivation experiment. In the designed cocultivation method the S. aureus CRISPRi library was cultivated with the udder microbiota bacteria Streptococcus dysgalactiae with a 1:8 inoculum ratio of the bacteria. A gene fitness analysis from CRISPRi-seq showed two genes that was more essential under cocultivation with S. dysgalactiae compared to S. aureus grown alone (glnR og pyrG), and two less essential genes (htsA og fhuC). glnR og pyrG is associated with biosynthesis and conversion of glutamine, while htsA og fhuC is associated with iron uptake. CRISPRi-seq of the coculture experiment showed few genes with significant differences in gene fitness of S. aureus grown as a monoculture and grown with S. dysgalactiae, which can be due to little interaction between bacteria. This suggests that the designed method can be improved in the future by better facilitating for interactions in the coculture. CRISPRi-seq is a screening method and in the future the results also need to be verified with for instance growth assays with knockout mutants or by examining individual CRISPRi strains with the significantly essential or less essential genes downregulated by sgRNA. This will form the basis of further understanding of how S. aureus is affected by being cultivated with S. dysgalactiae.