Virulence traits in different strains of Legionella pneumophila

Abstract

Different strains of Legionella are found ubiquitous in natural environments. Certain strains, such as Legionella pneumophila sero- group 1 are known as human pathogens, causing severe pneumonia. Legionella is naturally a parasite to protozoa, but shows similar intracellular growth in human alveolar macrophages. Prevention of growth of the bacteria and spread of the disease caused by pathogenic strains of Legionella is in the interest of the Norwegian Defense Research Institute (FFI) as a model organism for air borne disseminated bacteria, and for pathogens with an intracellular life cycle in eukaryotic cells. Not all Legionella species are able to replicate in amoeba, and co-culture with amoeba is considered to be selective to pathogenic strains of Legionellae. To investigate pathogenic traits of different strains of Legionella, several experiments were carried out in this study. Co-cultures of Legionella with Acanthamoeba castellanii and human macrophage THP1 cells were cultivated to investigate the ability of intracellular growth. Ten isolates of Legionella, including different sero- groups of L. pneumophila, along with L. micdadei, and an unknown Legionella species was used in co-culture experiments. Real-Time PCR analyses with SYBR Green were performed on the different strains with different primer sets in order to map the presence of the virulence genes known as rtx, lvh, dot, mip and hsp in each strain. Eventually, the registered presence of virulence genes was compared to each strains’ ability to replicate intracellularly in eukaryotes. The strains are originally obtained both from clinical isolates after outbreaks, and from environmental samples, as well as common reference strains. Several of the L. pneumophila strains in addition to L. micdadei commited intracellular growth in amoeba, by a growth factor of approximately 3 log units CFU/ml. Intracellular growth in macrophages was only accomplished by two strains in one of two repetitions of the experiment. The two strains had a growth by 3 log units. Evaluations of PCR analyses mapped the presence or absence of the 5 virulence genes in the different strains. Some of the strains with all five virulence genes detected were not able to replicate in eukaryotes in these experiments (L. pneumophila Colitax and Philadelphia), while one strain with only one virulence gene did replicate in amoebae (L. micdadei). No correlation was found in the ability of the tested Legionella strains to multiply in co-culture experiments with amoeba and macrophages. Also, for some strains the infectivity of amoeba and macrophages did not correspond to the presence of selected virulence genes identified using real-time PCR. The findings in this study that only two strains were able to multiply in macrophages indicate methodological problems, and the method needs to be improved in future studies. The results of PCR amplification of selected virulence genes were difficult to interpret concerning whether or not the gene was present. Using sequence specific probes would highly improve the results. The discoveries made in this thesis can be used further in establishing improved detection methods for pathogenic strains of Legionella. Ulike Legionella- stammer er allestedsnærværende i naturen. Enkelte stammer, slik som Legionella pneumophila sero- gruppe 1 er kjent som patogen for mennesker, og kan gi alvorlig lungebetennelse. I naturen er Legionella hovedsakelig en parasitt for protozoer, men kan utføre liknende intracellulær vekst i alveolære menneske- makrofager. Å hindre vekst av bakterien og spredning av sykdommen forårsaket av patogene stammer av Legionella er av interesse for Forsvarets Forskningsinstitutt (FFI) som en modellorganisme for luftbåren bakterie- spredning, og for patogene mikroorganismer med en intracellulær livssyklus i eukaryote celler. Ikke alle Legionella- arter kan replikere i amøber. Derfor blir sam-kultur med amøber regnet for å være selektiv for patogene stammer av legioneller. For å undersøke patogene trekk ved ulike stammer av Legionella ble ulike eksperimenter utført i denne studien. Sam-kulturer av Legionella med Acanthamoeba castellanii og menneske- makrofag THP1 celler ble dyrket for å undersøke stammenes evne til å vokse intracellulært. Ti individuelle isolater av Legionella, inkludert ulike sero- grupper av L. pneumophila, sammen med L. micdadei, og en ukjent Legionella- art ble brukt i sam-kulturer. Sanntids PCR analyser med SYBR Green ble utført på de ulike stammene med ulike primer- sett for å kartlegge tilstedeværelsen av virulensgenene kjent som rtx, lvh, dot, mip og hsp i hver stamme. Til slutt ble den registrerte tilstedeværelsen av virulensgener sammenliknet med hver stammes’ evne til å replikere intracellulært i eukaryoter. Stammene kommer opprinnelig fra kliniske isolater, fra miljøprøver og fra ofte brukt referansestammer. Flere av L. pneumophila- stammene, i tillegg til L. micdadei foretok intracellulær vekst i amøber, med en vekst- faktor på omtrent 3 log- enheter koloniformende enheter per ml. Intracellulær vekst i makrofager ble kun oppnådd av to stammer, og kun i ett av to forsøk. De to stammene hadde en vekst på 3 log enheter. PCR analysene ble evaluert til tilstedeværelse eller fravær av de 5 ulike genene i de ulike stammene, og varierte fra 1 til 5 gener. Noen av stammene med alle fem gener detektert replikerte ikke i eukaryoter (L. pneumophila Colitax og Philadelphia), mens en stamme med kun ett av virulensgenene replikerte i amøber (L. micdadei). Det ble ikke funnet noen sammenheng i infektiviteten til Legionella- stammene mellom amøber og makrofager. Infektiviteten korresponderte heller ikke med tilstedeværelsen av flest mulig virulensgener. Resultatene i denne studien indikerer en utilstrekkelig metode for å infisere makrofager med Legionella. PCR- resultatene var vanskelige å evaluere i forhold til om genet var tilstede eller ikke. Bruk av sekvens- spesifikke prober ville forbedre resultatene betydelig. Oppdagelsene gjort i denne studien kan bli brukt videre i å etablere bedre egnet deteksjonsmetoder for patogene stammer av Legionella.