Bacteriocin-based treatment of Staphylococcus haemolyticus biofilm

Abstract

Antibiotics have long been used to treat infections caused by pathogenic and multidrugresistant (MDR) bacteria. However, an increasing number of bacteria, including pathogenic bacteria, have developed resistance against most antibiotics. As a consequence, there is now a great need for the development of novel antimicrobial agents that can be utilized in clinical settings. One potential option is a subgroup of antimicrobial peptides known as bacteriocins, which have many advantageous properties which make them viable and very attractive alternatives to conventional antibiotics in the fight against pathogenic bacteria. In this study, the newly designed and bioengineered hybrid bacteriocin EntK1EJ97, which interacts with the Zn-dependent RseP receptor and causes pore formation in the bacterial cell membrane, revealed a relatively broad-spectrum of activity against a sizable collection of Gram-positive bacterial species from various genera and was very active against the clinically important and biofilm producing opportunistic pathogen Staphylococcus haemolyticus. The bacterial species S. haemoyticus is a member of the coagulase-negative staphylococci (CoNS) and may cause both local and systemic infections in humans. Comparative antimicrobial susceptibility with conventional antibiotics and EntK1EJ97 showed that EntK1EJ97 could be an attractive alternative treatment against S. haemolyticus, although EntK1EJ97-resistant mutants was generated. Microtiter plate biofilm assay with crystal violet staining of biofilm producing sessile cells revealed that S. haemolyticus was a very strong in vitro biofilm producer under optimal conditions. For the purpose of preventing the generation of planktonic and sessile biofilm producing EntK1EJ97-resistant mutants, various single and combinatorial bacteriocin treatments were applied in vitro in which the triple combinatorial EntK1EJ97/GarKS/MP1 treatment was most effective. The EntK1EJ97-resistant phenotype was investigated through temperature-stress assay, sequencing of the rseP gene encoding the RseP receptor, and by evaluating any morphological differences with the use of TEM. The temperature-stress assay and sequencing indicated that the RseP was functional and that no mutations had occurred at the DNA-level of the RseP. However, interesting differences in the thickness and structure of the EntK1EJ97-sensitive and resistant mutants cell wall was observed which might perhaps explain the phenotype of the EntK1EJ97-resistant S. haemolyticus mutants.

Antibiotika har lenge vært brukt til å behandle infeksjoner forårsaket av patogene og multiresistente (MDR) bakterier. Imidlertid har et økende antall bakterier, inkludert patogene bakterier, utviklet resistens mot de fleste antibiotika. Som en konsekvens er det nå et stort behov for utvikling av nye antimikrobielle midler som kan brukes i kliniske omgivelser. Et potensielt alternativ er en undergruppe av antimikrobielle peptider, kjent som bakteriociner, som har mange fordelaktige egenskaper som gjør dem levedyktige og veldig attraktive alternativer til konvensjonelle antibiotika i kampen mot sykdomsfremkallende bakterier. I denne studien avslørte den nylige designede og bioingenierte hybride bakteriocinet EntK1EJ97, som interagerer med den Zn-avhengige RseP-reseptoren og forårsaker poredannelse i bakteriecellemembranen, et relativt bredt spekter av aktivitet mot en betydelig samling av Gram-positive bakteriearter fra forskjellige slekter og var veldig aktiv mot den klinisk viktige og biofilmproduserende opportunistiske patogenen Staphylococcus haemolyticus. Den bakterielle arten S. haemoyticus er medlem av de koagulase-negative stafylokokkene (CoNS) og kan forårsake både lokale og systemiske infeksjoner hos mennesker. Sammenlignende antimikrobiell mottakelighet med konvensjonelle antibiotika og EntK1EJ97 viste at EntK1EJ97 kan være en attraktiv alternativ behandling mot S. haemolyticus, selv om EntK1EJ97-resistente mutanter ble generert. Mikrotiterplatebiofilmanalyse med krystallfiolett farging av biofilm-produserende sessile celler avslørte at S. haemolyticus var en veldig sterk in vitro biofilmprodusent under optimale forhold. For å forhindre generering av planktoniske og sessile biofilm-produserende EntK1EJ97-resistente mutanter, ble forskjellige enkelt- og kombinatoriske bakteriocinbehandlinger brukt in vitro der den tredobbelte kombinatoriske EntK1EJ97/GarKS/MP1-behandlingen var mest effektiv. Den EntK1EJ97-resistente fenotypen ble undersøkt gjennom temperatur-stressanalyse, sekvensering av rseP-genet som koder for RseP-reseptoren, og ved å evaluere eventuelle morfologiske forskjeller ved bruk av TEM. Temperatur-stressanalysen og sekvenseringen indikerte at RseP var funksjonelt og at ingen mutasjoner hadde skjedd på DNA-nivået til RseP. Imidlertid ble det observert interessante forskjeller i tykkelsen og strukturen til celleveggen hos EntK1EJ97-sensitive og resistente mutanter, noe som kanskje kan forklare fenotypen til de EntK1EJ97-resistente S. haemolyticus mutantene.