| dc.description.abstract | English: Denitrification is an anaerobic, microbial, step-wise process, reducing nitrate through the intermediates nitrite, NO and N2O to N2. Because NO and N2O are gases, they can escape the soil into the atmosphere. This is particularly bad for N2O , which is a green house gas with over 200 times the potency of CO2. There are a lot of different factors at play when it comes to why soil bacteria not always complete denitrification all the way to N2, but pH seems to be a major player. When soil pH sinks, the emission of N2O rises.
Even though molecular methods are capable of extract both DNA and RNA from soil to analyse the different denitrification genes, there is still need to study of how one species express denitrification. Studies of pure cultures are the best way to see whether or not the transcription of a gene to mRNA leads to the translation of a functioning reductase.
This thesis has as a goal to isolate bacteria from soil with high (7.4) and low (3.7) pH to build a local collection of denitrifying bacteria for our research group. It also became the start of the development of a new method for identifying nitrate reduction, denitrification and phenotypes within the denitrification process, all in the same bottle.
To get an as wide isolation as possible, diluted soil slurry was plated on 1/10 Tryptic Soy Agar, and incubated aerobically for 14 days at 20 °C. Colonies were picked based on colour, size, consistency and shape, isolated on agar as well as inoculated into small flasks for gass analysis containing 1/10 Tryptic Soy Broth with 1mM nitrate and 1mM nitrite. At turbidity, the flasks were capped and sealed with a rubber septa and an aluminium cap. The headspace was rinsed and made anaerobic with helium. 1% N2O and 1% O2 was added to the headspace.
After 7 days the amount of N2 and N2O was quantified by gas chromatography, with an auto sampling system developed by the research group. Nitrite and NO was quantified in through the use of a Nitric Oxide Analyser. Isolates capable of reducing one or more of the compounds were sent to 16S rRNA sequencing.
Out of 99 isolates from the pH 7.4 soil, 41 isolates were capable of reducing one or more of nitrate, nitrite, NO and N2O. 8 isolates were able to reduce nitrate/nitrite to N2. 11 were only capable of reducing nitrate. There were isolated bacteria from19 genera from 13 families, 10 orders and 7 classes.
The isolation of bacteria from the pH 3.7 soil was split in two. 50 isolates were grown on medium with pH 7.5 (same medium as the isolates from the pH 7.4 soil grew on) while 33 isolates were grown on medium with pH 5.7. Out of 50 isolates on pH7.5 medium, 25 were positive for reduction of nitrate, nitrite, NO and/or N2O. None of the isolates were able to reduce nitrate or nitrite all the way to N2O. One isolate was able to reduce N2O to N2, and 3 isolates reduced nitrate and nitrite to NH4+ through dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA.). Bacteria were isolated from 6 families, 4 order and 3 classes. A whole of 18 of 33 isolates grown on acidic medium were capable of reducing nitrate, nitrite, NO and/or N2O. Ten isolates reduced nitrate/nitrite all the way to N2.
Norwegian
Denitrifikasjon er ein anaerob mikrobiologisk prosess som reduserar nitrat via mellomprodukta nitritt, NO og N2O til N2. Sidan NO og N2O er gassar, er både i stand til å sleppa ut i atmosfæren. Særleg ille er N2O, som er over 200 gonger meir potent som drivhusgass enn CO2. Det er mange ulike faktorar som spelar inn når det gjeld kvifor mikroorganismane i jorda ikkje alltid er i stand til å fullføra denitrifikasjonen heilt til N2, men pH ser ut til å spela ein stor rolle. Når pH i jordsmonnet synk, stig utsleppet med N2O.
Sjølv om molekylære metodar er i stand til å trekkje ut både DNA og RNA frå jord for analysering av dei ulike gena som er involvert i denitrifikasjon, har ein likevel behov for å kunna studera korleis enkeltorganismar utfører denitrifikasjon. Studiar av organismen i reinkultur er den sikraste måten ein kan seie kor vidt transkripsjonen av eit gen til mRNA fører til translasjon av eit fungerande protein.
Denne oppgåva hadde som mål å isolere bakteriar frå høg-pH og låg-pH jord til ei lokal samling for forskingsgruppa. Det vart òg starten på utviklinga av ein ny metode for å identifisere nitratreduksjon, denitrifikasjon og andre fenotypar innan denitrifikasjonsprosessen samstundes, i same flaske.
For å få ei så brei isolering som mogleg, vart fortynna jord/vatn-blanding platespreidd på 1/10 Tryptic Soy Agar (TSA) og inkubert aerobt 14 dagar ved 20 °C. Koloniar vart så utvalde på bakgrunn av utsjånad (farge, storleik, konsistens), isolerte på ny agar, men også inokulert i flytande medium i små flasker for gassanalye. Flaskene innehald 1mM nitrat og 1 mM nitritt, og flytekulturane vart inkubert til vekst var synleg. Då vart flaskene kaplsa med gummisepta og aluminiumshette og lufta i flaskene vart bytta om med heliumsgass, 1% O2 og 1% N2O.
Etter 7 dagar vart mengda N2 og N2O i flaskene fastsett ved hjelp av gaskromatografi, i eit system som er utvikla av gruppa. NO og nitritt vart måla på ein «Nitric oxide analyzer». Bakteriar positive for reduksjon av eitt eller fleire av dei tilsette komponentane vart teke vidare til 16S rRNA sekvensering.
Av 99 isolat isolerte frå jord med pH 7.4 var 41 isolat positive for reduksjon av nitrat, nitritt, NO og/eller N2O. 8 isolat var i stand til å redusera nitrat/nitritt til N2, 11 reduserte berre nitrat. Det vart isolert bakteriar frå 19 slekter, 13 familiar, 10 ordenar og 7 klassar.
Isolasjonen av bakteriar frå jord med pH 3.7 var delt i to. 50 isolat vart dyrka på og i medium med pH 7.5 (same vekstmediet som bakteriane frå pH 7.4 jorda hadde), medan 33 isolat vart dyrka på medium med pH 5.7. Det var 25 isolat isolert på det nøytrale vekstmediet som var positive for reduksjon av nitrat, nitritt, NO og/eller N2O. Ingen var i stand til å redusera nitrat/nitritt til N2, eitt isolat kunne redusera N2O til N2 og 3 reduserte nitrat og nitritt til NH4+ gjennom «dissimilatory nitrate reduction to ammonium» (DNRA). Det vart isolert bakteriar frå 6 familiar, 4 ordenar og 3 klassar. Det var 18 av 33 isolat dyrka på surt medium som var i stand til å redusere nitrat, nitritt, NO og/eller N2O. 10 av dei reduserte nitrat/nitritt heile vegen til N2. | nb_NO |
